一種當(dāng)歸scar分子標(biāo)記及其鑒定方法和特異性引物對的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種當(dāng)歸SCAR分子標(biāo)記及其鑒定方法和 特異性引物對。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(01iv. )Diels的干燥根。具有補血、活 血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥滑腸的作用，早在兩千多年前，中國古代人民已用它治療疾病，至今，當(dāng) 歸在臨床仍有廣泛的用途，素有"十方九歸"之說，故其市場需求量很大，市場面臨著優(yōu)質(zhì)當(dāng) 歸供不應(yīng)求的局面。當(dāng)歸由于其使用背景和來源復(fù)雜，國內(nèi)以"當(dāng)歸"、"土當(dāng)歸"、"野當(dāng)歸" 之名作當(dāng)歸正品使用的"同名異物"較多，替代、以假充真現(xiàn)象愈加頻繁。其中，與正品當(dāng)歸 形態(tài)特征相似的傘形科植物如：獨活屬的物種、柴胡屬物種、當(dāng)歸屬種的阿壩當(dāng)歸、東當(dāng)歸、 歐當(dāng)歸等常作為當(dāng)歸的替代品和偽品混用，民間使用比較混亂。這些植物的化學(xué)成分與正 品當(dāng)歸相差甚遠(yuǎn)，應(yīng)當(dāng)慎用。
[0003] 現(xiàn)有的對當(dāng)歸的鑒別主要采用顯微鑒別和理化鑒別等傳統(tǒng)手段。而目前市售藥材 多為加工品，當(dāng)歸與其混偽品的表面性狀、顯微特征甚至化學(xué)成分都極其相似，在實際運用 中要進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別難度極大，且存在主觀性大，通用性差，且對觀察者經(jīng)驗要求高等缺陷， 不利于標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化方法的建立及普及。DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)具有快速、微量、準(zhǔn)確且特 異性強等特征，為解決藥材的鑒別問題提供了客觀而有效的手段。
[0004] 隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，目前少數(shù)文獻(xiàn)報道了對當(dāng)歸的分子鑒定：李明 等（當(dāng)歸及其混偽品的過氧化物同工酶電泳鑒別[J].中藥材，2000,23(4) :200.)利 用過氧化物同工酶對當(dāng)歸及其混偽品鑒定，但這種方法也僅限于采集新鮮的植株進(jìn) 行，對藥材飲片無法鑒別。Feng等和本研宄小組（FENG T，LIU S，HE XJ. Molecular authentication of the traditional Chinese medicinal plant Angelica sinensis based on internal transcribed spacer of nrDNA. Electronic Journal of Biotechnology, 2010, 13 (I) : 1-13。張春，王曉麗，稅王先，朱焊，莊元春·中藥當(dāng)歸及其混 偽品的rDNA ITS序列分析與鑒別，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，29 (2) :218-224.)利用ITS序 列對當(dāng)歸及其混偽品進(jìn)行了鑒別，但是需要對序列進(jìn)行測序和聚類分析方能區(qū)別。鑒別過 程較為繁瑣，且測序費用昂貴，需要時間較長也增加了檢測成本。本研宄小組利用ISSR技 術(shù)進(jìn)行了當(dāng)歸的分子鑒定（張春，朱燁，何穎，莊元春，基于內(nèi)部簡單重復(fù)系列_ISSR_分析 的當(dāng)歸分子鑒定.中國藥學(xué)雜志，2014, 49 (10) :812-816)。該方法需要對多條引物進(jìn)行擴 增，并對電泳條帶進(jìn)行數(shù)據(jù)分析才能得出可靠結(jié)果。
[0005] 綜上，上述對當(dāng)歸的傳統(tǒng)鑒別方法，在實際運用中要進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別難度極大，且存 在主觀性大，通用性差，且對觀察者經(jīng)驗要求高等缺陷。而分子鑒別手段比較準(zhǔn)確可靠，但 都需要測序或是大量PCR和電泳及后期數(shù)據(jù)處理，也不利于規(guī)?；瘶?biāo)準(zhǔn)化建立。
[0006] 因此有必要開發(fā)一種結(jié)果準(zhǔn)確且鑒定過程簡便快速的分子鑒定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，提供一種結(jié)果準(zhǔn)確靈敏，鑒 定過程簡便快速的當(dāng)歸鑒定方法。
[0008] 為達(dá)到以上目的，本發(fā)明的發(fā)明人在對大量的ISSR引物篩選過程中，尋找出正品 當(dāng)歸的特異性擴增條帶并轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，提供了對當(dāng)歸鑒別較為快速，簡便，廉價的方 法。
[0009] 本發(fā)明提供了一種當(dāng)歸SCAR分子標(biāo)記，其核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測本發(fā)明所述的當(dāng)歸SCAR分子標(biāo)記的PCR擴增特異 性引物對，所述引物對的核苷酸序列為：
[0011] 上游引物：5' -ACCCATTTGTAAACATAGCC-3'（SEQ ID No :2 所示序列）
[0012] 下游引物：5' -CAGATTCTCCTTCCACCC-3'（SEQ ID No :3 所示序列）。
[0013] 在引物設(shè)計階段，發(fā)明人考慮到在實際應(yīng)用過程中，擴增易于進(jìn)行且特異性較好， 擴增區(qū)段最好大于500bp。為了降低引物合成成本，引物長度限制在20bp左右，末端不能含 有3個以上連續(xù)堿基，特別是AAA和TTT。引物之間不能形成二聚體，自身不能形成發(fā)夾結(jié) 構(gòu)，退火溫度不能低于50度。按照以上原則發(fā)明人設(shè)計了 10對引物，并分別對這10對引 物的目的片段擴增效果進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所提供的PCR擴增特異性引物與其他9對引 物相比取得了最佳的擴增效果。例如所涉及的10對引物的其中一對的序列為：
[0014] 826L: 5 ' -GTAAACATAGCCGCACAAA-3 '，
[0015] 826R: 5 ' -CTGCCAAGCCTCACAAAC-3 '。
[0016] 但這對引物擴增后出現(xiàn)了 2條擴增條帶，特異性不夠好，因此被淘汰。
[0017] 本發(fā)明的另一個方面提供了一種當(dāng)歸SCAR分子標(biāo)記的鑒定方法，所述方法包括： 以待測樣品的總DNA為模板，利用本發(fā)明所提供的引物對進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，并對擴增產(chǎn)物 進(jìn)行電泳檢測。
[0018] 可選的，所述PCR擴增反應(yīng)的體系為：
[0019] 試劑 體積成 終濃度 DNA模板 1μ￡ 30 ng/^iL l〇x反應(yīng)緩沖液 2μ【 dNTP 2μL 0.2 mmol-L'1 MgC 12 ljiL 1.5 mmol-L"1
[0020] 正向引物 IpL 1.0 μιτιο?-?'1 反向引物 IpL I-Opmol-L4 Ex Taq酶 0.2μΙ, 1.25 U 總計： 20μL
[0021] 可選的，所述PCR擴增反應(yīng)的程序為：
[0022] 95°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 40s，60°C退火 40s，72°C延伸 lmin，共 35 個循環(huán)；72°C 后延伸8min。
[0023] 本發(fā)明通過上述引物、反應(yīng)體系、反應(yīng)程序能夠取得最佳的對當(dāng)歸SCAR分子標(biāo)記 的鑒定效果，能夠更加準(zhǔn)確快速的將當(dāng)歸與其他樣品分開。
[0024] 可選的，所述待測樣品選自當(dāng)歸、阿壩當(dāng)歸、東當(dāng)歸、歐當(dāng)歸、紫花前胡、白芷、北柴 胡、白亮獨活、獨活、藁本、川芎、川明參、羌活、峨眉當(dāng)歸、小茴香、防風(fēng)、鴨兒芹和野胡蘿卜 中的一種或多種。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種用于鑒定當(dāng)歸的試劑盒，包括本發(fā)明所提供的特異性引物 對。
[0026] 利用本發(fā)明所提供的分子標(biāo)記，可以準(zhǔn)確的將正品當(dāng)歸與形態(tài)特征相似的植物區(qū) 分開，利用本發(fā)明所提供的引物和方法進(jìn)行當(dāng)歸SCAR分子標(biāo)記鑒定，PCR擴增的特異性好， 在實際應(yīng)用中，無需在當(dāng)歸鑒別時篩選大量的引物，也無需根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)估算樣品間的 遺傳相似性和構(gòu)建遺傳聚類圖譜，具有快速，簡便和低成本的優(yōu)越性。
【附圖說明】
[0027] 圖1為用引物UBC826對當(dāng)歸及其混偽品29個樣本擴增電泳圖
[0028] M:DL2000DNA marker,數(shù)字編號同表1，箭頭所指為當(dāng)歸特異擴增條帶。
[0029] 圖2本發(fā)明所提供的特異性引物對對當(dāng)歸及其混偽品29個樣本的擴增電泳圖
[0030] M:DL2000DNA marker,數(shù)字編號同表 1。
【具體實施方式】
[0031] 下面將通過【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0032] 實施例1
[0033] I. I DNA的提取與檢測
[0034] 取IOmg經(jīng)硅膠快速干燥的待測材料在液氮中研磨成細(xì)粉，使用DNA提取試劑盒 (北京天根DP305)提取總DNA。過1%凝膠電泳，全自動凝膠成像系統(tǒng)分析DNA的完整性及 純度。用微