一種研究水稻與病原物互作模式的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種研宄水稻與病原物互作模式的方 法，更具體為基于轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組（iTRAQ)及miRNA組聯(lián)合研宄水稻-稻瘟病菌互作機(jī)制 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻（Oryza Sativa)是世界上重要的糧食作物之一，養(yǎng)活著全球半數(shù)以上的人 口。由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae)侵染引起的稻瘟病，是水稻生產(chǎn)上的重要限制因素， 它具有傳播速度快、發(fā)生范圍廣、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)。隨著水稻和稻瘟病菌全基因組測(cè)序計(jì)劃 的相繼完成，水稻-稻瘟病菌的互作機(jī)制研宄已成為植物-病原物互作機(jī)制研宄的模式系 統(tǒng)。
[0003] 水稻與稻瘟病菌的互作是一個(gè)十分復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的過程，涉及到眾多基因的表達(dá)與 調(diào)控而形成的連續(xù)信號(hào)逐級(jí)傳導(dǎo)的過程，主要包括三個(gè)階段：信號(hào)分子的產(chǎn)生和識(shí)別，通常 有JA、SA及ET等植物激素類信號(hào)，Ca 2+、活性氧（ROS)及一氧化氮（nitric oxide，NO)等 第二類信使類信號(hào)，谷胱甘肽（glutathione，GSH)等小分子肽類、脂類和糖類等信號(hào)分子； 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳導(dǎo)，如跨膜GTP結(jié)合蛋白、胞間Ca 2+通道、鈣依賴性蛋白激酶CDPK、促分裂 原活化蛋白激酶MAPK的級(jí)聯(lián)以及磷酸酶催化的蛋白質(zhì)的磷酸化/去磷酸化；防衛(wèi)反應(yīng)的開 啟和系統(tǒng)獲得抗性的產(chǎn)生。而每次的傳導(dǎo)都可產(chǎn)生相應(yīng)的生化反應(yīng)，從而發(fā)揮相應(yīng)的生理 功能，完成特定的生物學(xué)效應(yīng)。
[0004] 前人已經(jīng)分別采用多種方法進(jìn)行了水稻響應(yīng)稻瘟病侵染的差異組學(xué)研宄，然而都 是單一的轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組學(xué)的研宄。其中，基因芯片技術(shù)主要揭示HiRNA水平的變化，單 純依賴該技術(shù)并不能客觀真實(shí)地揭示植物與病原物的具體互作機(jī)制，而蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也 大多數(shù)采用基于2D電泳分離和質(zhì)譜鑒定聯(lián)合應(yīng)用，屬于對(duì)于一個(gè)細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)進(jìn) 行的定性研宄，僅能確定蛋白質(zhì)的身份但不能對(duì)蛋白質(zhì)的功能給出最終定論。雖然差異蛋 白質(zhì)組學(xué)能顯著克服差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)的局限性，但實(shí)際上蛋白的表達(dá)變化與基因的表達(dá)變 化并不十分一致，這可能是由mRNA的剪接、翻譯調(diào)控或翻譯后加工和蛋白質(zhì)降解等因素 引起的，這無(wú)疑會(huì)影響對(duì)植物與病原物的互作機(jī)制的真實(shí)闡明，而miRNA的鑒定則可以很 好的將蛋白質(zhì)組學(xué)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果有機(jī)的統(tǒng)一起來。因此，采用單一的方法與技術(shù)去研 宄稻瘟病抗病性反應(yīng)，難以真正的揭示其復(fù)雜的分子抗性機(jī)制，而綜合利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、定量 蛋白質(zhì)組學(xué)（iTRAQ)進(jìn)行差異組學(xué)的分析，兩者不匹配的地方進(jìn)一步借助miRNA進(jìn)行分析 以確定轉(zhuǎn)錄后水平或者蛋白質(zhì)翻譯水平是否被調(diào)控所導(dǎo)致的，有望較為全面真實(shí)的揭示水 稻-稻瘟病的具體互作機(jī)制以進(jìn)一步闡明植物抗病的分子機(jī)理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種研宄水稻與 病原物（稻瘟病菌）互作模式的方法，用以克服現(xiàn)有單一技術(shù)的研宄效果不準(zhǔn)確的問題。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種研宄水稻與病原物互作模式的方法， 綜合應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組（iTRAQ)及miRNA組研宄水稻響應(yīng)病原物侵染的互作模式的方 法，其具體步驟包括：
[0007] A.別取接種病原物前后不同時(shí)間點(diǎn)的抗病材料及感病材料的水稻葉片總RNA、 Small RNA及總蛋白；
[0008] B.分別進(jìn)行差異表達(dá)譜分析、差異蛋白質(zhì)組學(xué)（iTRAQ)分析及miRNA鑒定及其靶 基因分析；
[0009] C.將三種方法鑒定出差異基因、蛋白、miRNA靶基因進(jìn)行整合、關(guān)聯(lián)以揭示水稻與 病原物互作過程中所激活或抑制的抗、感病反應(yīng)途徑，從而可以較為系統(tǒng)的闡明水稻-稻 瘟病菌的互作機(jī)制。
[0010] 步驟A所述的病原物優(yōu)選為稻瘟病菌。
[0011] 步驟A所述的接種稻瘟病菌前后不同時(shí)間點(diǎn)優(yōu)選為Oh和24h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)。
[0012] 步驟A的具體步驟包括：分別取接種稻瘟病菌前后Oh和24h兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的 抗病材料及感病材料的葉片，液氮研磨、離心、裂解處理，并分別進(jìn)行總RNA、總蛋白及Small RNA的制備及相應(yīng)的質(zhì)量檢測(cè)。
[0013] 步驟B中所述的差異表達(dá)譜分析的具體步驟包括：使用NucIeoSpin K RNA Clean-up (MN)純化步驟A所得的RNA并進(jìn)行雙鏈cDNA的合成、純化；然后體外轉(zhuǎn)錄 合成生物素標(biāo)記cRNA，純化cRNA后進(jìn)行cRNA的片段化處理；使用 AffymetHx Λ Hybridization Oven 640 將試驗(yàn)材料 cRNA 與芯片雜交；通過 Affymetrix? Fluidics Station 450 進(jìn)行洗脫、染色；使用 Affymetrix+GeneChip? Scanner3000 掃描芯片，用 AffymetrixK'Ge_neChipK) Operating Software VersionL 4軟件分析芯片雜交圖像，把圖 像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，并用dChip軟件（http://www. dchip. org)做校正和標(biāo)準(zhǔn)化處理； 每個(gè)探針在不同時(shí)間點(diǎn)和不同處理間比較以確定差異表達(dá)相關(guān)基因。
[0014] 步驟B中所述的差異蛋白質(zhì)組學(xué)（iTRAQ)分析的具體步驟包括：將步驟A所得的 蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步FASP酶解、肽段標(biāo)記、SCX分級(jí)及LC-MS質(zhì)譜分析，進(jìn)一步對(duì)所得 的質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)查庫(kù)、定量分析，進(jìn)行GO聚類分析，選取差異倍數(shù)>1. 2或〈0. 8、 p-value〈0. 05的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析初步確定差異表達(dá)相關(guān)蛋白。
[0015] 步驟B中所述的miRNA鑒定及其靶基因分析的具體步驟包括：對(duì)步驟A所回收的 18_30nt small RNA與5' adaptor、3' adaptor連接，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于Solexa High-throughput Sequencer (Illumina, USA)進(jìn)行測(cè)序，將 Solexa 測(cè)序所得的 35nt 序列， 通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染、統(tǒng)計(jì)序列長(zhǎng)度及分布過程完成初級(jí)分析，進(jìn)一步對(duì)初級(jí)分 析所得到的序列作分類注釋，獲得樣品中包含的各組分及表達(dá)量信息。對(duì)差異miRNA進(jìn)行 靶基因預(yù)測(cè)以得到可能調(diào)控的靶基因信息，并對(duì)靶基因進(jìn)行Go分類及KEGG通路分析。
[0016] 步驟C的具體步驟包括：對(duì)差異表達(dá)譜鑒定的差異基因、差異蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的 差異蛋白及miRNA預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行三者的關(guān)聯(lián)分析，以較為全面地揭示水稻與稻瘟病菌 互作的復(fù)雜分子機(jī)制。
[0017] 步驟C中所述的差異表達(dá)譜鑒定的差異基因?yàn)椴町惐稊?shù)為2倍以上的基因。
[0018] 步驟C中所述的差異蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定的差異蛋白為差異倍數(shù)為I. 2倍以上的蛋 白。
[0019] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0020] 本發(fā)明能夠較完整的鑒定出參與水稻-稻瘟病菌互作過程中的差異基因/蛋白， 本發(fā)明實(shí)施例利用該方法鑒定了一些水稻響應(yīng)稻瘟病侵染過程中的發(fā)生變化的基因/蛋 白；本發(fā)明方法對(duì)深入揭示水稻-稻瘟病互作機(jī)制提供了一個(gè)方法借鑒；在利用轉(zhuǎn)基因技 術(shù)培育抗稻瘟病品種上具有重要的參考價(jià)值。其優(yōu)點(diǎn)為：①能快速和有效地篩選到與水稻 抗病相關(guān)聯(lián)的候選基因；②本發(fā)明很好的利用基因芯片技術(shù)、iTRAQ技術(shù)及miRNA的深度測(cè) 序等這些高通量、準(zhǔn)確的組學(xué)研宄手段來研宄與水稻抗稻瘟病相關(guān)的候選基因/蛋白；③ 可以廣泛應(yīng)用于植物抗病等性狀的研宄和開發(fā)并且結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)來培育抗病性強(qiáng)的植 物新品種。
【附圖說明】
[0021] 圖1差異表達(dá)譜鑒定的部分差異基因的GO功能注釋分析；其中注：
[0022] 細(xì)胞組件（1-細(xì)胞、2-細(xì)胞部分、3-膜、4-細(xì)胞外區(qū)、5-細(xì)胞外區(qū)部分、6-高分 子配合物、7-膜蛋白、8-細(xì)胞器、9-細(xì)胞器部分、10-合成酶、11-合成酶部分）分子功能 (12-抗氧化、13-結(jié)合、14-催化活性、15-電子載體、16-酶調(diào)節(jié)、17-金屬伴侶、18-轉(zhuǎn)運(yùn)活 性、19-營(yíng)養(yǎng)存儲(chǔ)、20-結(jié)構(gòu)分子、21-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、22-翻譯調(diào)節(jié)、23-運(yùn)輸、生物學(xué)途徑（24-解 剖結(jié)構(gòu)的形成、25-生物粘連、26-生物調(diào)節(jié)、27-細(xì)胞組件發(fā)生、28-細(xì)胞組件組織、29-細(xì)胞 進(jìn)程、30-死亡、31-發(fā)育過程、32-定位的建立、33-生長(zhǎng)、34-免疫過程、35-定位、36-運(yùn)動(dòng)、 37-代謝過程、38-多種生物過程、39-多細(xì)胞生物過程、40-色素沉著、41-生殖、42、生殖過 程、43-應(yīng)激反應(yīng)、44-周期性過程）
[0023] 圖2 iTRAQ差異蛋白質(zhì)