含免疫細(xì)胞組合物的制造方法及癌治療用組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及含免疫細(xì)胞組合物的制造方法及癌治療用組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，在癌的治療中開發(fā)出各種方法，強(qiáng)化患者的體內(nèi)免疫力的免疫療法尤其 受關(guān)注。作為免疫療法，可以列舉例如細(xì)胞免疫療法等。
[0003] 細(xì)胞免疫療法為如下方法，即，使來自患者的免疫細(xì)胞在體外活化及增殖等后，將 其再次返送至該患者的體內(nèi)，從而提高該患者的免疫力，也被稱為過繼免疫療法（cellular adoptive immunotherapy)等。例如，作為細(xì)胞免疫療法之一的LAK療法是如下方法：從由 患者采集的血液分離單核細(xì)胞，使其主要分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞等后返回患者的體內(nèi)。此 外，作為其它細(xì)胞免疫療法，已知有使用NK細(xì)胞等細(xì)胞的方法（例如，專利文獻(xiàn)1)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005] 專利文獻(xiàn)
[0006] 專利文獻(xiàn)1:日本特表2011-529341號公報

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明要解決的課題
[0008] 另一方面，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，即使如現(xiàn)有的細(xì)胞免疫療法那樣使單核細(xì)胞向細(xì)胞毒 性T細(xì)胞等單一免疫細(xì)胞分化、使其增殖后將獲得的培養(yǎng)物返回生物體內(nèi)，也未必能夠強(qiáng) 化生物體內(nèi)的免疫力。因此，本發(fā)明的目的在于，使單核細(xì)胞均衡地分化為多種免疫細(xì)胞 (尤其是NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞及T細(xì)胞）并使這些細(xì)胞增殖。
[0009] 用于解決課題的手段
[0010] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過在免疫細(xì)胞的制造方法中組合規(guī)定的細(xì)胞培養(yǎng)工序可以解決 上述課題，直至完成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明提供以下方案。
[0011] (1) -種含免疫細(xì)胞組合物的制造方法，其含有：
[0012] 在含有IL-2和/或IL-15、以及抗⑶16單克隆抗體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞的第 1工序，以及
[0013] 在上述第1工序后，在使單核細(xì)胞優(yōu)先分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞的條件下進(jìn)行培養(yǎng) 的第2工序。
[0014] (2)根據(jù)（1)所述的含免疫細(xì)胞組合物的制造方法，其中，還包含：在上述第2工 序后，在含有IL-2和/或IL-15、以及抗CD16單克隆抗體的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的第3工序。
[0015] (3) -種癌治療用組合物，其含有利用（1)或（2)所述的制造方法制造的含免疫細(xì) 胞組合物。
[0016] 發(fā)明的效果
[0017] 根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種使單核細(xì)胞均衡地分化為NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞及T細(xì)胞 并使這些細(xì)胞增殖的方法。
【附圖說明】
[0018] 圖1中，㈧表示從6名健康人回收的PBMC的細(xì)胞數(shù)。（B-I)及（B-2)表示獲得 的PBMC的FACS分析的代表性結(jié)果。
[0019] 圖2表示從健康人回收的PBMC的FACS分析的代表性結(jié)果。
[0020] 圖3表示本發(fā)明的實施例中獲得的含免疫細(xì)胞組合物的FACS分析的代表性結(jié)果。
[0021] 圖4表示本發(fā)明的實施例中獲得的含免疫細(xì)胞組合物的FACS分析的結(jié)果。
[0022] 圖5表示本發(fā)明的實施例中獲得的含免疫細(xì)胞組合物的細(xì)胞毒活性的測定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0023] 以下，對本發(fā)明的實施方式進(jìn)行說明，但并非意圖限定本發(fā)明。
[0024] 本發(fā)明的含免疫細(xì)胞組合物的制造方法含有在規(guī)定條件下進(jìn)行培養(yǎng)的第1工序 和第2工序。以下，對各工序進(jìn)行說明。予以說明，本發(fā)明中"含免疫細(xì)胞組合物"是指，至 少含有NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞及T細(xì)胞的組合物。
[0025] <第1工序（NK細(xì)胞增殖工序）>
[0026] 本發(fā)明中的第1工序為如下工序，即在后述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞，使單核細(xì) 胞分化為NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞等，且使NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞等增殖。在該工序中，不僅可使單 核細(xì)胞選擇性分化為NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞并擴(kuò)增，而且可使單核細(xì)胞選擇性分化為γ δ T細(xì) 胞等并擴(kuò)增。已知NK細(xì)胞（自然殺傷細(xì)胞）、NKT細(xì)胞（自然殺傷T細(xì)胞）、γ δ T細(xì)胞分 別為淋巴細(xì)胞的一種，具有攻擊癌細(xì)胞的作用。予以說明，本發(fā)明中"ΝΚ細(xì)胞等"至少是指 NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞。
[0027] (單核細(xì)胞）
[0028] 單核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞的總稱。單核細(xì)胞可使用離心分離、磁珠、流式細(xì) 胞術(shù)等公知的方法由體液（末梢血、骨髓、臍帶血等血液等）獲得。單核細(xì)胞也可以是由 iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞及體干細(xì)胞等干細(xì)胞誘導(dǎo)出的單核細(xì)胞。本發(fā)明中，可優(yōu)選使用末梢血單 核細(xì)胞（PBMC)等作為單核細(xì)胞。
[0029] 作為用于采集細(xì)胞免疫療法中所必需的單核細(xì)胞的現(xiàn)有方法，已知有使用成分采 血裝置分離血液中的白細(xì)胞的方法（將該方法稱為"血漿分離置換法"）。但是，血漿分離 置換法不僅需要裝置的運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用，而且為了操作裝置還需要有高度的技術(shù)。
[0030] 進(jìn)而，為了通過細(xì)胞免疫療法獲得期望的治療效果，返回患者體內(nèi)的總免疫細(xì)胞 數(shù)在例如使用淋巴細(xì)胞時為10億個以上是理想的。但是，由于血液中存在的單核細(xì)胞的比 例少，因此為了確保10億個以上的細(xì)胞數(shù)，通常需要以一定間隔對同一對象進(jìn)行多次的血 漿分離置換法。但是，多次的血漿分離置換法在體力上時間上都給患者帶來非常大的負(fù)擔(dān)。 此外，通過血漿分離置換法能夠采集到的單核細(xì)胞數(shù)會根據(jù)患者的血液狀態(tài)等而變化。
[0031] 另一方面，本發(fā)明的制造方法由于能夠使單核細(xì)胞有效地分化為免疫細(xì)胞并使免 疫細(xì)胞增殖，因此可以減少用于獲得單核細(xì)胞的血液量（例如，1~IOOmU優(yōu)選1~50mL)， 且采血1次即已經(jīng)足夠。因此，本發(fā)明與目前使用的血漿分離置換法等方法相比，能夠顯著 降低為了獲得單核細(xì)胞而施加給患者的負(fù)擔(dān)（費(fèi)用、時間等）。但是，本發(fā)明中的單核細(xì)胞 也可以是通過血漿分離置換法而獲得的單核細(xì)胞。
[0032] (培養(yǎng)基）
[0033] 第1工序中的培養(yǎng)基含有IL_2(白介素-2)和/或IL_15(白介素-15)、以及抗 CD16單克隆抗體。含有IL-2、IL-15及抗CD16單克隆抗體的培養(yǎng)基由于尤其能夠使單核 細(xì)胞選擇性地分化為NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γ δ T細(xì)胞等而優(yōu)選。利用該培養(yǎng)基，可以使單核 細(xì)胞分化為NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、γ δ T細(xì)胞等，并使這些免疫細(xì)胞增殖。
[0034] 用于由單核細(xì)胞向NK細(xì)胞等分化及增殖的優(yōu)選培養(yǎng)基中，IL-2的濃度沒有特別 限定，可以為1~200000IU/mL、優(yōu)選為100~200000IU/mL、最優(yōu)選為1000~200000IU/ mL。此外，用于由單核細(xì)胞向NK細(xì)胞等分化及增殖的優(yōu)選培養(yǎng)基中，IL-15的濃度沒有特別 限定，可以為1~100ng/mL、優(yōu)選為1~50ng/mL、最優(yōu)選為1~30ng/mL。此外，用于由單 核細(xì)胞向NK細(xì)胞等分化及增殖的優(yōu)選培養(yǎng)基中，抗CD16單克隆抗體的濃度沒有特別限定， 可以為 1 ~l〇〇〇〇〇ng/mL、優(yōu)選為 10 ~100000ng/mL、最優(yōu)選為 100 ~100000ng/mL。IL-2、 IL-15及抗⑶16單克隆抗體可以以上述濃度范圍配合在第1工序中的培養(yǎng)基中。
[0035] 本發(fā)明中的培養(yǎng)基中除了 IL-2和/或IL-15、以及抗⑶16單克隆抗體外，還可 以含有公知的NK細(xì)胞刺激劑（抗NKp46抗體等）、NKT細(xì)胞刺激劑（抗TCRVa24抗體、抗 TCRVbll抗體、α -半乳糖神經(jīng)酰胺等）、γ δ T細(xì)胞刺激劑（抗TCRy / δ抗體、來膦酸等） 等。這些成分在培養(yǎng)基中的配合量可以根據(jù)想要獲得的細(xì)胞量等適當(dāng)調(diào)整。
[0036] 本發(fā)明的培養(yǎng)基中還可以含有用于使單核細(xì)胞變得能夠培養(yǎng)的營養(yǎng)成分、pH調(diào)整 劑等。作為含有所述成分的培養(yǎng)基，沒有特別限定，可以列舉淋巴細(xì)胞用無血清合成培養(yǎng)基 (KB550、KB570 等）、AM-V、DC 培養(yǎng)基、DMEM、RPMI-1640、X-VIV0 培養(yǎng)基等。此外，本發(fā)明中 的培養(yǎng)基的形態(tài)沒有特別限定，可以是調(diào)制前的成分混合物（粉體等）、調(diào)制后的形態(tài)（液 體等）等°
[0037] 本發(fā)明的培養(yǎng)基中，還可以含有細(xì)胞培養(yǎng)中通常使用的試劑。作為這樣的試劑，可 以列舉抗生素（慶大霉素、卡那霉素等）、白蛋白、血清（人血清、胎牛血清等）、2_巰基乙 醇、丙酮酸鈉、胰島素等增殖因子、L-谷氨酰胺、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。
[0038] 含有IL-2和/或IL-15、以及抗⑶16單克隆抗體的培養(yǎng)基可以通過公知的培養(yǎng) 基制造方法調(diào)制，例如，可以通過在上述培養(yǎng)基成分中添加 IL-2和/或IL-15、以及抗⑶16 單克隆抗體而調(diào)制。此外，含有抗CD16單克隆抗體的培養(yǎng)基，還可以通過將抗CD16單克隆 抗體預(yù)先涂敷在燒瓶上并在該燒瓶中添加抗CD16單克隆抗體以外的培養(yǎng)基成分、從而調(diào) 制含有抗CD16單克隆抗體的培養(yǎng)基。
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