新重組因子c、其制造方法、及內(nèi)毒素的測定法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及新重組因子C、其制造方法、及內(nèi)毒素的測定法。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁外膜上的脂多糖，且己知是強(qiáng)致熱原。 此外，己知的是，即使少量的內(nèi)毒素也會造成歸因于細(xì)菌感染的不同疾病狀態(tài)，諸如由巨噬 細(xì)胞活化引起的炎癥性細(xì)胞因子的釋放和內(nèi)毒素性休克的誘導(dǎo)以及發(fā)熱。因此，以注射用 藥為代表的藥物、水、醫(yī)療設(shè)備等中的內(nèi)毒素的檢測是重要的。此外，內(nèi)毒素被認(rèn)為是革蘭 氏陰性細(xì)菌感染中的休克的主要原因，因此，通過測量血液中的內(nèi)毒素，可以判定感染的有 無及治療效果。
[0003] 此外，己知的是，若革蘭氏陰性細(xì)菌感染美洲豐（Limulus polyphemus)，則會引起 血液凝固，該現(xiàn)象被用于內(nèi)毒素的檢測。
[0004] g卩，已知使用鱟血細(xì)胞提取液（鱟的變形細(xì)胞溶解物，下文中也稱為"溶解物"）測 定內(nèi)毒素的方法（例如，非專利文獻(xiàn)1)。該方法被稱為鱟試驗，利用存在于溶解物中的各種 蛋白質(zhì)的級聯(lián)反應(yīng)，該反應(yīng)是通過使內(nèi)毒素與溶解物接觸而發(fā)生的。級聯(lián)反應(yīng)的示意圖示 于圖1。
[0005] 在內(nèi)毒素與溶解物接觸后，存在于溶解物中的作為絲氨酸蛋白酶前體的因子C被 活化而生成活化型因子C。該活化型因子C使存在于溶解物中的因子B活化，生成活化型因 子B。該活化型因子B使存在于溶解物中的凝固酶原活化，生成凝固酶。
[0006] 該凝固酶將存在于溶解物中的凝固蛋白原分子中的特定部位水解。由此，生成凝 固蛋白凝膠，以使溶解物凝固。因此，通過測定溶解物的凝固反應(yīng)，可以測定內(nèi)毒素。
[0007] 此外，通過使凝固酶與合成底物發(fā)生作用，從而使顯色反應(yīng)進(jìn)行，也可以測定內(nèi) 毒素。例如，凝固酶作用于作為合成底物的叔丁氧羰基-亮氨?；?甘氨酰基-精氨酰 基-pNA (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)，將其酰胺鍵水解，使PNA游離。由此，通過使反應(yīng)體系中 存在所述合成底物，可以測定顯色物質(zhì)（PNA)的吸光度（405nm)，從而可以對內(nèi)毒素進(jìn)行定 量。
[0008] 此外，已知的是，使用從日本鱟的溶解物純化出的因子C、因子B及凝固酶原，可以 重構(gòu)級聯(lián)反應(yīng)體系（非專利文獻(xiàn)2)。
[0009] 但是，為了利用溶解物或由此純化出的因子C、因子B及凝固酶原，需要捕獲鱟并 采集血液，從保護(hù)生物資源的觀點出發(fā)，難以無限地供給這些成分。因此，需要通過基因工 程學(xué)的方式生產(chǎn)這些成分并重構(gòu)級聯(lián)反應(yīng)體系的技術(shù)。
[0010] 例如，已知下述例子：使用昆蟲細(xì)胞作為宿主細(xì)胞來表達(dá)因子C、因子B及凝固酶 原，重構(gòu)級聯(lián)反應(yīng)體系（專利文獻(xiàn)1、2)。但是報道了：在該重構(gòu)體系中，通過使反應(yīng)體系中 存在氯化鈉、硫酸鎂或氯化鈣，可抑制級聯(lián)反應(yīng)（專利文獻(xiàn)1)。
[0011] 另一方面，作為使用哺乳類細(xì)胞作為宿主細(xì)胞的例子，已知下述例子：使用非 洲綠猴腎細(xì)胞來源的細(xì)胞株COS-ι作為宿主細(xì)胞，表達(dá)新加坡豐（Carcinoscorpius rotundicauda，圓尾豐）來源的因子C。但是，在使用COS-I作為宿主細(xì)胞的情況下，據(jù)報道 所表達(dá)的因子C為不溶性（非專利文獻(xiàn)3、4)。即，尚未知將哺乳類細(xì)胞用作宿主細(xì)胞來生 產(chǎn)功能性的因子C的例子。
[0012] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0013] 專利文獻(xiàn)
[0014] 專利文獻(xiàn)1 :國際公開第2008/004674號小冊子
[0015] 專利文獻(xiàn)2 :國際公開第2012/118226號小冊子
[0016] 非專利文獻(xiàn)
[0017] 非專利文獻(xiàn) I :Iwanaga S.，Curr. Opin. Immunol. Feb ;5 (1) : 74-82 (1993)
[0018] 非專利文獻(xiàn) 2 :Nakamura T.，et al.，J. Biochem. Mar ;99 (3) : 847-57 (1986)
[0019] 非專利文獻(xiàn) 3 :Roopashree S. Dwarakanath, et al.，Biotechnology lettersl9(4):357-361(1997)
[0020] 非專利文獻(xiàn) 4 : Jing Wang, Bow Ho and Jeak L. Ding, Biotechnology letters23:71-76(2001)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 發(fā)明要解決的問題
[0022] 本發(fā)明的課題在于提供鱟的新重組因子C及制造該重組因子C的方法。
[0023] 此外，注射至生物體內(nèi)的注射劑大多含有各種鹽（離子）。另一方面，在它們的制 造中，各國藥典賦予了確認(rèn)內(nèi)毒素的義務(wù)。因此，本發(fā)明的一個方式的課題在于，提供一種 在鹽（離子）的存在下難以受到反應(yīng)抑制的級聯(lián)反應(yīng)的重構(gòu)體系。
[0024] 用于解決問題的方案
[0025] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過將人細(xì)胞或中國倉鼠細(xì)胞用作宿主細(xì)胞，可以制造鱟的重組 因子C ;以及通過使用如此制造的重組因子C，可以在鹽（離子）的存在下降低反應(yīng)抑制，測 定內(nèi)毒素，由此完成了本發(fā)明。
[0026] 即，本發(fā)明包括以下的方案。
[0027] [1]
[0028] 一種鱟的因子C，其具有因子C的活性。
[0029] [I. I. 1]
[0030] 上述因子C，其具有唾液酸。
[0031] [1.1.2]
[0032] 上述因子C，其具有（α -2, 3)鍵的末端唾液酸。
[0033] [I. 1. 3]
[0034] 上述因子C，其與天然因子C相比具有較多的（α-2,3)鍵的末端唾液酸。
[0035] [I. 1. 4]
[0036] 上述因子C，其與將Sf9用作宿主細(xì)胞所表達(dá)的鱟的因子C相比，具有較多的 (α-2, 3)鍵的末端唾液酸。
[0037] [I. 1. 5]
[0038] 上述因子C，其中，在用懷槐凝集素 （Maackia amurensis Agglutinin)進(jìn)行凝集素 印跡時，與天然因子C相比顯示出較高的反應(yīng)性。
[0039] [I. 1. 6]
[0040] 上述因子C，其中，在用懷槐凝集素 （Maackia amurensis Agglutinin)進(jìn)行凝集素 印跡時，與將Sf9用作宿主細(xì)胞所表達(dá)的鱟的因子C相比顯示出較高的反應(yīng)性。
[0041] [1.2.1]
[0042] 上述因子C，在21mM的檸檬酸鈉的存在下，顯示出10%以上的殘留活性。
[0043] [1. 2. 2]
[0044] 上述因子C，在21mM的檸檬酸鈉的存在下，顯示出20%以上的殘留活性。
[0045] [1. 2. 3]
[0046] 上述因子C，在52mM的碳酸氫鈉的存在下，顯示出25%以上的殘留活性。
[0047] [1. 2. 4]
[0048] 上述因子C，在52mM的碳酸氫鈉的存在下，顯示出35%以上的殘留活性。
[0049] [1. 2. 5]
[0050] 上述因子C，在214mM的氯化鈉的存在下，顯示出25%以上的殘留活性。
[0051] [1.2.6]
[0052] 上述因子C，在214mM的氯化鈉的存在下，顯示出35%以上的殘留活性。
[0053] [1. 2. 7]
[0054] 上述因子C，在16mM的硫酸鎂的存在下，顯示出15%以上的殘留活性。
[0055] [1. 2. 8]
[0056] 上述因子C，在16mM的硫酸鎂的存在下，顯示出25%以上的殘留活性。
[0057] [1. 2. 9]
[0058] 上述因子C，在2. 5mM的氯化鈣的存在下，顯示出35%以上的殘留活性。
[0059] [1. 2. 10]
[0060] 上述因子C，在2. 5mM的氯化鈣的存在下，顯示出45%以上的殘留活性。
[0061] [1.2.11]
[0062] 上述因子C，在21mM的檸檬酸鈉的存在下，與將Sf9用作宿主細(xì)胞所表達(dá)的鱟的因 子C和/或天然因子C相比，顯示出較高的殘留活性。
[0063] [1. 2. 12]
[0064] 上述因子C，在52mM的碳酸氫鈉的存在下，與將Sf9用作宿主細(xì)胞所表達(dá)的鱟的因 子C和/或天然因子C相比，顯示出較高的殘留活性。
[0065] [1. 2. 13]
[0066] 上述因子C，在214mM的氯化鈉的存在下，與將Sf9用作宿主細(xì)胞所表達(dá)的鱟的因 子C和/或天然因子C相比，顯示出較高的殘留活性。
[0067] [1. 2. 14]
[0068] 上述因子C，在16mM的硫酸鎂的存在下，與將Sf9用作宿主細(xì)胞所表達(dá)的鱟的因子 C和/或天然因子C相比，顯示出較高的殘留活性。
[0069] [1. 2. 15]
[0070] 上述因子C，在2. 5mM的氯化鈣的存在下，與將Sf9用作宿主細(xì)胞所表達(dá)的鱟的因 子C和/或天然因子C相比，顯示出較高的殘留活性。
[0071] [1.3.1]
[0072] 上述因子C，其為下述（A)、（B)、（C)、或（D)所示的蛋白質(zhì)：
[0073] (A)包含序列號2所不的氣基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0074] (B)包含在序列號2所示的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插 入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白質(zhì)；
[0075] (C)包含序列號4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0076] (D)包含在序列號4所示的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插 入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白質(zhì)。
[0077] [1. 3. 2]
[0078] 上述因子C，其為下述（A)或（B)所示的蛋白質(zhì)：
[0079] (A)包含序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0080] (B)包含在序列號2所示的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插 入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白質(zhì)。
[0081] [1. 4]
[0082] 上述因子C，其為重組蛋白。
[0083] [1. 5. 1]
[0084] 上述因子C，其在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為115kDa~140kDa。
[0085] [1. 5. 2]
[0086] 上述因子C，其在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為115kDa~130kDa。
[0087] [1. 5. 3]
[0088] 上述因子C，其在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為120kDa~130kDa。
[0089] [1. 5. 4]
[0090] 上述因子C，其在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為120kDa~128kDa。
[0091] [1.5.5]
[0092] 上述因子C，其在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為127kDa±5kDa。
[0093] [1. 5. 6]
[0094] 上述因子C，其在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為128kDa±2kDa。
[0095] [1. 5. 7]
[0096] 上述因子C，其在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為127kDa±2kDa。
[0097] [1. 5. 8]
[0098] 上述因子C，其在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為126kDa±2kDa。
[0099] [1. 5. 9]
[0100] 上述因子C，其在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為127kDa± lkDa。
[0101] [I. 6]
[0102] 上述因子C，其為水溶性。
[0103] [1. 7]
[0104] 上述因子C，其為包含因子C的培養(yǎng)上清。
[0105] [1. 8]
[0106] 上述因子C，其具有下述（1)~（3)所示的性質(zhì)：
[0107] (1)具有因子C的活性；
[0108] (2)在非還原SDS-PAGE中測定的分子量為115kDa~130kDa ;及
[0109] (3)在21mM的檸檬酸鈉的存在下，顯示出10%以上的殘留活性。
[0110] [2]
[0111] 一種制造鱟的因子C的方法，該方法包括將哺乳類細(xì)胞用作宿主細(xì)胞而表達(dá)鱟的 因子C。
[0112] [2.1.1]
[0113] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為C0S-1以外的哺乳類細(xì)胞。
[0114] [2.1.2]
[0115] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為選自由靈長類和嚙齒類組成的組中的哺乳動 物的細(xì)胞。
[0116] [2.1.3]
[0117] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為靈長類的細(xì)胞。
[0118] [2.1.4]
[0119] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為嚙齒類的細(xì)胞。
[0120] [2.1.5]
[0121] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為選自由除猴外的靈長類和嚙齒類組成的組中 的哺乳動物的細(xì)胞。
[0122] [2.1.6]
[0123] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為中國倉鼠的細(xì)胞或人的細(xì)胞。
[0124] [2.1.7]
[0125] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為中國倉鼠的細(xì)胞。
[0126] [2.1.8]
[0127] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為人的細(xì)胞。
[0128] [2.1.9]
[0129] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為CHO或HEK。
[0130] [2. 1. 10]
[0131] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為CH0。
[0132] [2. 1. 11]
[0133] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為HEK。
[0134] [2. 1. 12]
[0135] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為CHO DG44或HEK293。
[0136] [2. 1. 13]
[0137] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為CHO DG44。
[0138] [2. 1. 14]
[0139] 上述方法，其中，所述哺乳類細(xì)胞為HEK293。
[0140] [2.2.1]
[0141] 上述方法，其中，所述因子C為下述（A)、（B)、（C)或（D)所示的蛋白質(zhì)：
[0142] (A)包含序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0143] (B)包含在序列號2所示的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插 入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白質(zhì)；
[0144] (C)包含序列號4所不的氣基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0145] (D)包含在序列號4所示的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插 入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白質(zhì)。
[0146] [2.2.2]
[0147] 上述方法，其中，所述因子C為下述（A)或⑶所示的蛋白質(zhì)：
[0148] (A)包含序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0149] (B)包含在序列號2所示的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的置換、缺失、插 入或添加的氨基酸序列、且具有因子C的活性的蛋白質(zhì)。
[0150] [3]
[0151] 一種鱟的因子C，其可以利用所述方法制造。
[0152] [3. 1]
[0153] 上述因子C，其具有因子C的活性。
[0154] [3.2.1]
[0155] 上述因子C，其具有唾液酸。
[0156] [3.2.2]
[0157] 上述因子C，其具有（α-2, 3)鍵的末端唾液酸。
[0158] [3.2.3]
[0159] 上述因子C，其與天然因子C相比具有較多的（α_2,3)鍵的末端唾液酸。
[0160] [3.2.4]
[0161] 上述因子C，其與將Sf9用作宿主細(xì)胞所表達(dá)的鱟的因子C相比，具有較多的 (α-2, 3)鍵的末端唾液酸。
[0162] [3.2.5]
[0163] 上述因子C，其中，在用懷槐凝集素 （Maackia amurensis Agglutinin)進(jìn)行凝集素 印跡時，與天然因子C相比顯示出較高的反應(yīng)性。
[0164] [3.2.6]
[0165] 上述因子C，其中，在用懷槐凝集素 （Maackia amurensis Agglutinin)進(jìn)行凝集素 印跡時，與將Sf9用作宿主細(xì)胞所表達(dá)的鱟的因子C相比顯示出較高的反應(yīng)性。
[0166] [3.3.1]
[0167] 上述因子C，在21mM的檸檬酸鈉的存在下，顯示出10%以上的殘留活性。
[0168] [3.3.2]
[0169] 上述因子C，在21mM的檸檬酸鈉的存在下，顯示出20%以上的殘留活性。
[0170] [3.3.3]
[0171] 上述因子C，在52mM的碳酸氫鈉的存在下，顯示出25%以上的殘留活性。
[0172] [3.3.4]
[0173] 上述因子C，在52mM的碳酸氫鈉的存在下，顯示出35%以上的殘留活性。
[0174] [3.3.5]
[0175] 上述因子C，在214mM的氯化鈉的存在下，顯示出25%以上的殘留活性。
[0176] [3.3.6]
[0177] 上述因子C，在214mM的氯化鈉的存在下，顯示出35%以上的殘留活性。
[0178] [3.3