苦參堿衍生物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及喹啉類、苯環(huán)類、苯并二噁烷類、萘環(huán)類和吲哚類苦參堿衍生物，還涉 及該衍生物的制備方法和在制藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 苦參堿作為苦參中的生物堿成分之一，研宄發(fā)現(xiàn)苦參堿具有廣泛的藥理活性?？?參堿在醫(yī)療方面具有對(duì)心血管系統(tǒng)、對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和對(duì)消化系統(tǒng)具有良好作用。如抗動(dòng) 脈粥樣硬化、抗心律失常、正性肌力和抗高血壓等作用；具有鎮(zhèn)靜、催眠、降溫等中樞抑制作 用；對(duì)抗胃黏膜損傷、利膽、止瀉、抗肝損傷等消化系統(tǒng)作用。在抗腫瘤方面，苦參堿具有直 接殺傷癌細(xì)胞效果。同時(shí)也具有一定的抗炎、抗病毒、免疫抑制等藥理活性。在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方 面，苦參堿對(duì)多種害蟲(chóng)、雜草和鼠具有毒殺和抑制作用。哌嗪類藥物具有抗焦慮、抗精神病、 抗菌、抗抑郁、抗高血壓和消炎止痛等生物活性而被廣泛的應(yīng)用。隨著研宄的深入，喹啉、苯 并二噁烷、萘環(huán)、吲哚類藥物的抗腫瘤活性也日益引起人們的重視。
[0003] 未見(jiàn)兼具苦參堿的抗腫瘤活性和喹啉、苯并二噁烷、萘環(huán)、吲哚類藥物的抗腫瘤活 性的相關(guān)藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可發(fā)揮苦參堿和喹啉、苯并二噁烷、萘環(huán)、吲 哚類藥物抗腫瘤活性協(xié)同作用的喹啉類、苯環(huán)類、苯并二噁烷類、萘環(huán)類和吲哚類苦參堿衍 生物。
[0005] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是提供喹啉類、苯環(huán)類、苯并二噁烷類、萘環(huán)類和吲 哚類苦參堿衍生物的制備方法和在制藥中的應(yīng)用。
[0006] 解決上述技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 喹啉類、苯環(huán)類、苯并二噁烷類、萘環(huán)類和吲哚類苦參堿衍生物，該衍生物為以下通式I至通式V的化合物之一：

上述的喹啉類、苯環(huán)類、苯并二噁烷類、萘環(huán)類和吲哚類苦參堿衍生物YFF-1~YFF-19 的制備方法，以苦參堿I為起始原料，經(jīng)過(guò)強(qiáng)堿使苦參堿內(nèi)酰胺鍵a位上的氫離去，形成 a-碳負(fù)離子，然后再與喹啉、苯環(huán)、苯并二噁烷、萘環(huán)和吲哚類化合物反應(yīng)即得。
[0007]上述的喹啉類、苯環(huán)類、苯并二噁烷類、萘環(huán)類和吲哚類苦參堿衍生物在制備抗腫 瘤藥物中應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明基于藥物拼合原理，通過(guò)化學(xué)的方法合成了一系列的喹啉、苯環(huán)、苯并二噁 烷、萘環(huán)、吲哚類苦參堿衍生物，實(shí)驗(yàn)表明這些衍生物能同時(shí)發(fā)揮苦參堿和喹啉、苯環(huán)、苯并 二噁烷、萘環(huán)、吲哚類藥物的抗腫瘤活性，具有一定的應(yīng)用參考意義。
[0009] 說(shuō)明書(shū)附圖 圖IYFF-7對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡效果 圖2YFF-7孵育下A549細(xì)胞的細(xì)胞周期分布 圖3YFF-7孵育下細(xì)胞內(nèi)ROS的A549細(xì)胞水平 【具體實(shí)施方式】： 苦參堿的結(jié)構(gòu)式和原子序號(hào)如下：
以下結(jié)合實(shí)施例具體說(shuō)明在苦參堿結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)明的喹啉、苯環(huán)、苯并二噁烷、萘環(huán)、 吲哚類苦參堿衍生物及其制備方法。
[0010] 實(shí)施例1 通式I中的YFF-l~YFF-9,通式II中的YFF-10~YFF-15,和通式IV中的YFF-19喹啉、 苯環(huán)、苯并二噁烷、萘環(huán)、吲哚類苦參堿衍生物的制備方法。
[0011] (1)制備化合物YFF-I 在氮?dú)獗Ｗo(hù)、冰浴條件下，將5mmol(1.24g)苦參堿溶于20mL無(wú)水四氫呋喃（THF)， 干燥注射器抽取6mmol(3mL)二異丙基氨基鋰（LDA)注射入反應(yīng)瓶中，室溫下攪拌反 應(yīng)30min后，冰浴下，用注射器向燒瓶?jī)?nèi)加入10mmol(1.89g)吲噪-2-羧酸乙醋，攪拌反 應(yīng)3h，薄層色譜檢測(cè)反應(yīng)完全后，加入IOmL飽和氯化鈉溶液猝滅反應(yīng)，三氯甲烷萃取（50 mLX3)，合并有機(jī)相，無(wú)水NaS04干燥，抽濾，濃縮濾液，通過(guò)硅膠柱層析純化（V甲醇：V乙 酸乙酯=1:10)，得到I. 03g白色粉末，收率為53%。
[0012] 參考化合物YFF-I的方法制備化合物YFF-2~YFF-9,YFF-10~YFF-15,YFF-19。
[0013]化合物YFF-l~YFF-9,YFF-10~YFF-15,YFF-19 結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下： 14-(2-吲哚甲酰基）苦參堿（YFF-I):白色粉末，熔點(diǎn)：174. 4-176.(TC，產(chǎn)率 53%;1HNMR( 600MHz,DMSO): 8ppm11.71 (s,IH), 7.70 (d,J=7.8Hz,IH), 7.46-7.43 (m, 2H), 7.29 (t,J= 7.8Hz,IH), 7.08 (t,J=7.8Hz,IH), 4.42 (t,J=6.0Hz, 1H), 4.19 (dd,J=4. 2Hz,J=12.6Hz,IH), 3.87-3.82 (m, 1H), 3.00 (t,J=12.6Hz,IH), 2.78-2.71 (m,IH), 2.10 (s,IH), 2.04-1.81 (m, 7H ),1-64-1.50 (m, 7H), 1.39-1.32 (m, 3H) ；IR(KBr,v/cm-1 ) : 3420, 2930, 2860, 2810, 2765, 1604, 1465, 1437, 1345, 1281, 1249, 1201, 1127, 1090, 1061, 761;MS,m/z: 391. 75 (M+ ) 14-(3-吲哚甲?；┛鄥A（YFF-2):白色粉末，熔點(diǎn)：167. 2-168. 0°C，產(chǎn)率57%;1HNMR( 600MHz,DMSO): 8ppm10.11 (s,IH), 8.45 (s,IH), 7.46-7.43 (m,


1475，1437，1311，1259，1127，1069;MS,m/z: 352.99 (M+) 實(shí)施例2 通式III中的YFF-16~YFF-18萘環(huán)類苦參堿衍生物的制備方法。
[0014] (1)制備化合物YFF-16 于IOOmL圓底燒瓶中分別加入116mmol(2.8g)氫化鈉，50mL無(wú)水四氫呋喃，攪拌均 勻，加入5mmol(1.24g)苦參堿，緩慢升溫至80°C加入10mmol(1.86g)6-甲氧基-2-萘 甲醛，反應(yīng)至終點(diǎn)（TLC檢測(cè)）。冷卻，用3N的鹽酸調(diào)節(jié)反應(yīng)液至中性。二氯甲烷萃?。?0 mLX3)，合并有機(jī)相，無(wú)水NaS04干燥，抽濾、濃縮濾液，得黃色油狀物。硅膠柱層析（V甲 醇：V乙酸乙酯=1:10)純化，得0. 81g白色固體14-[2-(6_甲氧基）萘甲烯基]苦參堿，收 率 39%。
[0015] (2)參考化合物YFF-16的方法制備化合物YFF-17~YFF-18.

通過(guò)本發(fā)明制備的上述哌嗪類苦參堿衍生物，其構(gòu)成純度在99%以上。
[0016] 以下表1給出了實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的目標(biāo)目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式：



藥理實(shí)驗(yàn) 體外抗腫瘤活性研宄 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)材料 腫瘤細(xì)胞：人類肺癌細(xì)胞（A549)，人類乳腺癌細(xì)胞（BT-20，MCF-7)，人胃癌細(xì)胞 (SGC-7901)，人肝癌細(xì)胞〇fepG2)，人類骨肉瘤細(xì)胞（U20S)購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞保藏中心（ATCC)。
[0017]藥品與儀器：RPMI1640 培養(yǎng)基（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，胎牛 血清（FBS)，青霉素一鏈霉素溶液（penicillin-str印tomycin)，DMEM高糖培養(yǎng)基 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，McCoy's5A培養(yǎng)基（Gibco,GrandIsland,NY)，阿 爾瑪藍(lán)試劑（Invitrogen,USA).SpectraMAXM5酶標(biāo)儀（MolecularDevicesInc.USA)、 流式細(xì)胞儀（BDFACSVantageDiva,USA)、FlowcellectTMAnnexinRedKit(Millipore, Billerica,MA,USA)，ArrayScan高內(nèi)涵篩選分析儀（ThermoScientific,USA),受試 藥，由廣西大學(xué)提供。
[0018]實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 所有藥物均溶解于二甲基亞砜（DMSO)中，并配置成IOOmM的儲(chǔ)存液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用培養(yǎng)基 將藥物稀釋成所需的濃度。對(duì)于細(xì)胞毒性試驗(yàn)，將細(xì)胞按4000個(gè)/孔的密度接種在96孔板 中，每孔100W細(xì)胞懸液。16小時(shí)后，待細(xì)胞徹底貼壁，小心吸走培養(yǎng)基，加入含不同藥物 濃度的培養(yǎng)基并將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44小時(shí)，然后加入阿爾瑪藍(lán)試劑繼續(xù)孵育3 小時(shí)。3小時(shí)后，通過(guò)SpectramaxM5酶標(biāo)儀測(cè)定570nm及600nm波長(zhǎng)處吸光值，并予以 計(jì)算各孔活細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次三個(gè)復(fù)孔。
[0019] 細(xì)胞周期和凋亡分析 對(duì)于細(xì)胞周期，首先通過(guò)血清剝奪饑餓法對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，然后用含不 同藥物濃度的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)，收集細(xì)胞并重懸于含70%乙醇的PBS 中，-20°C過(guò)夜，用以進(jìn)行細(xì)胞周期分析。通過(guò)流式細(xì)胞儀及細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各細(xì) 胞周期所占百分比。對(duì)于細(xì)胞凋亡，將細(xì)胞按3X105密度接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼 壁后用含不同藥物濃度的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)流式細(xì)胞儀及細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑 盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次。
[0020] 氧化應(yīng)激試驗(yàn) 將A549細(xì)胞按3X105密度接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后用含不同藥物濃度的 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。之后，加入50yL含有二氫乙的預(yù)熱染色溶液和赫斯特染料，并 在37°C，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘。然后收集細(xì)胞，并使用ArrayScan高 內(nèi)涵篩選分析儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量。
[0021] 細(xì)胞存活率的計(jì)算公式： 細(xì)胞存活率（％)=藥物組平均OD值/對(duì)照組平均OD值X100% 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)alamarblue法測(cè)定了化合物對(duì)A549,H印G2,SGC-7901和MCF-7的抑制活性，其 中化合物YFF-7，YFF-13，YFF-15是測(cè)定了其對(duì)細(xì)胞A549,MCF-7,BT-20,U20S的抑制活 性。結(jié)果如表2所示，除個(gè)別化合物對(duì)某個(gè)癌細(xì)胞的抑制活性比苦參堿弱，其他的化合物均 顯示出較好的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。
[0022] 表2目標(biāo)化合物對(duì)A549,MCF-7,SGC-7901，IfepG2,BT-20和U20S細(xì)胞增殖的抑制 Table2.InhibitionofA549,MCF-7,SGC-7901,HepG2,BT-20andU20Scell proliferationbythetargetcompounds
由于YFF-7具有良好的抗腫瘤活性，對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步的藥理測(cè)試。測(cè)試結(jié)果如下： 細(xì)胞周期調(diào)控在細(xì)胞增殖過(guò)程中扮演了至關(guān)重要的角色。藥物往往通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 發(fā)生細(xì)胞周期阻滯從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，如圖1所示，YFF-7能夠劑量依賴 性地將A549細(xì)胞周期阻滯在Gl期。
[0023] 細(xì)胞凋亡在維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡可以進(jìn)一 步評(píng)估藥物的抗腫瘤活性。如圖2所示，YFF-7能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0024] 細(xì)胞凋亡的發(fā)生往往與細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS)的產(chǎn)生有關(guān)，為了進(jìn)一步闡明YFF-7 弓丨起的細(xì)胞凋亡，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了藥物處理下細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。如圖3所示，YFF-7 能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.嗟咐類、苯環(huán)類、苯并二曠燒類、蒙環(huán)類和嘲噪類苦參堿衍生物，其結(jié)構(gòu)特征如下；通式V:2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗟咐類、苯環(huán)類、苯并二曠燒類、蒙環(huán)類和嘲噪類苦參堿衍生 物YFF-1~YFF-19的制備方法，其特征在于W苦參堿I為起始原料，經(jīng)過(guò)強(qiáng)堿使苦參堿內(nèi)酷 胺鍵a位上的氨離去，形成a-碳負(fù)離子，然后再與嗟咐類、苯環(huán)類、苯并二曠燒類、蒙環(huán)類 和嘲噪類化合物反應(yīng)即得。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗟咐類、苯環(huán)類、苯并二曠燒類、蒙環(huán)類和嘲噪類苦參堿衍生 物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種苦參堿衍生物，包括喹啉類、苯環(huán)類、苯并二噁烷類、萘環(huán)類和吲哚類苦參堿衍生物，還公開(kāi)了該衍生物的制備方法和在制藥中的應(yīng)用。
【IPC分類】A61K31/4375, C07D471/22, A61P35/00, A61K31/4545, A61K31/4709
【公開(kāi)號(hào)】CN104926814
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510322838
【發(fā)明人】王立升, 楊方方, 梁鵬云, 周中杰, 劉華文, 張森
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年6月14日