一種高產(chǎn)繡球菌誘變菌株及培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開一種高產(chǎn)繡球菌誘變菌株，為一種新的菌株品種，本發(fā)明還提供了該 菌株的培育方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 繡球菌Sparassis crispa是非裙孔菌目、繡球菌科、繡球菌屬。其發(fā)酵培養(yǎng)得到 的菌絲體產(chǎn)物可抗腫瘤、提高免疫力、恢復(fù)疲勞、祛斑美白，治療糖尿病、高血壓、腦血栓等 疾病，均取得顯著療效。
[0003] 在本發(fā)明中，選育了一株繡球菌優(yōu)良高產(chǎn)菌株，其發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體產(chǎn)量較野生型 繡球菌有顯著提高，對其深入研宄和廣泛應(yīng)用具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)繡球菌誘變菌株，為一種新的菌株，其發(fā)酵產(chǎn)物 菌絲體產(chǎn)量較原始野生菌相比有顯著提高。
[0005] 本發(fā)明還提供了該菌株的培育方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明的繡球菌誘變菌株：在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址：武漢武 漢大學(xué)，保藏日期：2015年5月3日，分類名稱：繡球菌SC031;Sparassis crispa SC031，保 藏登記號為 CCTCC NO:M 2015275。
[0007] 本發(fā)明所述的高產(chǎn)繡球菌菌株培育方法，包括以下步驟： 1) 將繡球菌原始菌株Sparassis crispa cfcc 6296,接種于PDA斜面，24_26°C恒溫箱 中培養(yǎng)5-7天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為 I X IO6個/mL的孢子懸液； 2) 取孢子懸液2 mL，加入I mL 0. 2M NaNO2溶液和I mL pH4. 4醋酸緩沖液，室溫震蕩 并計時，誘變30 min，取0.1 mL懸液加入到5 mL 0. 2M pH8. 0磷酸緩沖液中，終止誘變，取 誘變后孢子懸液于無菌生理鹽水中逐級稀釋，PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)5-7天后，將菌株于48孔 板保存； 3) 用滅菌的牙簽將48孔板中菌株挑到PDA培養(yǎng)基的平板上，用平板篩選生長迅速的菌 株； 4) 篩選生長較迅速的菌落，將其挑到盛有PDA培養(yǎng)基的搖瓶中復(fù)蘇6 d ;將菌株傳代培 養(yǎng)，在盛有100 mL PDA培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，接種繡球菌誘變菌株菌懸液3 mL，26°C 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 d; 5) 將誘變得到的突變菌株保存于試管斜面培養(yǎng)基中，離心菌絲體，5000 rpm，離心10 min，水洗一次，菌絲體鋪于平板凍干，凍干粉末稱重，粉碎，過60目篩，測定其胞內(nèi)多糖含 量，篩選高產(chǎn)的繡球菌菌株； 本發(fā)明所述的繡球菌高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)基，其特征在于是由以下藥物按重量份數(shù)比制成 的：蔗糖 20 g/L、酵母浸粉 20 g/L、MgS04 · 7H20 3 g/L、KH2P04 3 g/L。
[0008] 本發(fā)明所述的高產(chǎn)繡球菌誘變株的特征為： 繡球菌誘變菌株菌絲體干重和胞內(nèi)多糖含量與原始菌株相比均有顯著提高，其中菌絲 體干重可達(dá)11122 g/L，較原始菌株提高了 3434% ;胞內(nèi)多糖含量可達(dá)123g/L，較原始菌株 提高了 123123% ;經(jīng)過10次以上的連續(xù)傳代培養(yǎng)不退化，具有遺傳穩(wěn)定性。
[0009] 本發(fā)明的積極效果在于：誘變的繡球菌新菌株經(jīng)10次以上傳代培養(yǎng)不退化，具有 遺傳穩(wěn)定性，并且發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體產(chǎn)量和胞內(nèi)多糖含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原始菌株。
[0010] 具體實施方法 為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而非對 本發(fā)明的任何形式的限制。
[0011] 實施例1: 繡球菌突變株的誘變和選育方法 (1)繡球菌誘變 將繡球菌原始菌株Sparassis crispa cfcc 6296,接種于PDA斜面，26°C恒溫箱中培 養(yǎng)7天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水I. 0 mL，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為 1\106個/1^的孢子懸液。取孢子懸液2 1^，加入111^0.21似勵2溶液和11111^!14.4醋 酸緩沖液，室溫震蕩并計時，誘變30 min，取0.1 mL懸液加入到5 mL 0. 2M pH8.0磷酸緩 沖液中，終止誘變，取誘變后孢子懸液于無菌生理鹽水中逐級稀釋，PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)6 天后，將菌株于48孔板保存。用滅菌的牙簽將48孔板中菌株挑到PDA培養(yǎng)基的平板上，每 板20個菌落，26°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天；將生長較迅速的菌落，再次挑到PDA培養(yǎng)基中， 每板10株左右，26°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天；將生長較迅速的菌落挑到盛有PDA培養(yǎng)基的 搖瓶中復(fù)蘇6天；將菌株傳代培養(yǎng)，在盛有100 mL PDA培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，接種繡 球菌誘變菌株菌懸液3 mL，26°C恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6天。將誘變得到的突變菌株保存于試管 斜面培養(yǎng)基中，離心菌絲體，5000 rpm，離心10 min，水洗一次，菌絲體鋪于平板凍干，凍干 粉末稱重，粉碎，過60目篩。
[0012] (2)胞內(nèi)多糖成分的提取及含量測定 稱取繡球菌菌絲體干粉〇. lg，加入5ml蒸餾水，80 °C水浴提取3h，8000rpm離心 lOmin，取上清液測定菌絲體胞內(nèi)多糖含量。采用蒽銅-硫酸法測定總糖含量，DNS方法測 定還原糖含量，多糖含量=總糖含量-還原糖含量。
[0013] (2)高產(chǎn)誘變株的篩選 從誘變的繡球菌突變體中，篩選出菌絲體干重明顯提高的優(yōu)良菌株(見表1 )，然后進(jìn)行 傳代培養(yǎng)，每隔一代測定菌株干重，測量方法同步驟（1 )，共培養(yǎng)10代，考察篩選得到高產(chǎn) 誘變株的穩(wěn)定遺傳特征。
[0014] 表1誘變困株四項指fe提尚值
實施例2: 繡球菌誘變菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 以菌絲體干重為考察指標(biāo)，進(jìn)行繡球菌誘變菌株T08發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。
[0015] 在培養(yǎng)基優(yōu)化的過程中，利用單因素實驗對影響期望值的碳源和氮源種類分別進(jìn) 行考察。
[0016] 1)碳源種類篩選 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別采用20 g/L蔗糖、果糖、甘油、麥芽糖、乳糖和葡萄糖 作為碳源，制備培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為100 mL/250 mL，分別以5%的接種量接入種子液， 150 rpm、26°C培養(yǎng)6天。測定每種碳源培養(yǎng)基條件下各菌絲體干重，以選擇合適的碳源種 類。結(jié)果采用蔗糖作為碳源時，其值最高，因此選擇蔗糖為最佳碳源。
[0017] 2)氮源種類篩選 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別采用20 g/L大豆蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨和 酵母浸粉作為氮源，制備培養(yǎng)基，培養(yǎng)基裝液量為100mL/250mL，以5%的接種量接入種子 液，150rpm、26°C培養(yǎng)6天。測定每種氮源培養(yǎng)基條件下各菌絲體干重，以選擇合適的碳源 種類。結(jié)果采用蔗糖作為碳源時，其值最高，因此選擇酵母浸粉為最佳碳源。
[0018] 綜合上述實驗結(jié)果，該繡球菌誘變菌株的培養(yǎng)基配方為（g/L):蔗糖20、酵母浸粉 20, MgSO4 · 7H20 3, KH2PO4 3〇
【主權(quán)項】
1. 一種高產(chǎn)繡球菌誘變菌株，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址：武漢武漢 大學(xué)，保藏日期：2015年5月3日，分類名稱：繡球菌SC031;SparassiscrispaSC031，保藏 登記號為CCTCCNO:M2015275。2. 培養(yǎng)權(quán)利要求1所述高產(chǎn)繡球菌菌株的方法，包括以下步驟： 1) 將繡球菌原始菌株Sparassiscrispacfcc6296,接種于PDA斜面，24_26°C恒溫箱 中培養(yǎng)5-7天，向斜面試管中注入無菌生理鹽水，振蕩后用無菌脫脂棉過濾，稀釋成濃度為 IXIO6個/mL的孢子懸液； 2) 取孢子懸液2mL，加入ImL0. 2MNaNO2溶液和ImLpH4. 4醋酸緩沖液，室溫震蕩 并計時，誘變30min，取0.ImL懸液加入到5mL0. 2MpH8. 0磷酸緩沖液中，終止誘變，取 誘變后孢子懸液于無菌生理鹽水中逐級稀釋，PDA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)5-7天后，將菌株于48孔 板保存； 3) 用滅菌的牙簽將48孔板中菌株挑到PDA培養(yǎng)基的平板上，用平板篩選生長迅速的菌 株； 4) 篩選生長較迅速的菌落，將其挑到盛有PDA培養(yǎng)基的搖瓶中復(fù)蘇6d;將菌株傳代培 養(yǎng)，在盛有100mLPDA培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，接種繡球菌誘變菌株菌懸液3mL，26°C 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6d; 5) 將誘變得到的突變菌株保存于試管斜面培養(yǎng)基中，離心菌絲體，5000rpm，離心10 min，水洗一次，菌絲體鋪于平板凍干，凍干粉末稱重，粉碎，過60目篩，測定其胞內(nèi)多糖含 量，篩選高產(chǎn)的繡球菌菌株。3. 培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)繡球菌菌株的培養(yǎng)基，其特征在于是由以下藥物按重 量份數(shù)比制成的：蔗糖20g/L、酵母浸粉20g/L、MgS04,7H20 3g/L、KH2P04 3g/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高產(chǎn)繡球菌誘變菌株及培育方法，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址：武漢大學(xué)，保藏日期：2015年5月3日，分類名稱：繡球菌SC031;Sparassis crispa SC031，保藏登記號為CCTCC NO:M2015275；該誘變的繡球菌新菌株經(jīng)10代以上傳代培養(yǎng)不退化，具有遺傳穩(wěn)定性，并且發(fā)酵菌絲體胞內(nèi)多糖含量比原始菌株高出許多倍。CCTCC NO:M201527520150503
【IPC分類】C12N15/01, C12N1/14, C12R1/645
【公開號】CN104928189
【申請?zhí)枴緾N201510285860
【發(fā)明人】滕利榮, 胡爽, 周毓麟, 王迪, 劉洋, 劉馨雨, 逯家輝, 孟慶繁, 權(quán)宇彤
【申請人】吉林大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月29日