對(duì)植物具有多種功能的海洋芽孢桿菌及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋微生物領(lǐng)域，具體的說(shuō)是由海洋生境獲得的芽孢桿菌，種名：海洋 芽孢桿菌（Bacillus marinus)，通過(guò)人工誘變育種及培養(yǎng)發(fā)酵，活菌制劑對(duì)栽培植物具有 防病、促生長(zhǎng)、誘導(dǎo)抗寒抗鹽的作用。該菌種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心（CGMCC)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保 藏日期2012年6月5日，保藏編號(hào)CGMCC No. 6187,分類(lèi)命名Bacillus marinus。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)產(chǎn)品安全是所有食品安全的的源頭，研發(fā)和使用高效低毒的生物農(nóng)藥是保證農(nóng) 產(chǎn)品安全的基本措施，活菌制劑是生物農(nóng)藥的一大種類(lèi)，這些有益菌通過(guò)定殖在植物體或 寄生在害蟲(chóng)體內(nèi)，發(fā)揮抑菌和殺蟲(chóng)等作用。芽孢桿菌是其中最著名的益生菌，作為各種酶的 產(chǎn)生菌廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)；作為飼料添加劑和醫(yī)藥，可抑制常見(jiàn)腸道病原菌，提高動(dòng)物抗 病能力，降低抗生素用量；其無(wú)毒、成本低、殺蟲(chóng)、抑菌能力強(qiáng)的特點(diǎn)，也為國(guó)內(nèi)外研發(fā)生物 農(nóng)藥所關(guān)注，是世界產(chǎn)量最大的生物農(nóng)藥，新資源、新用途的發(fā)現(xiàn)更是國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥領(lǐng)域爭(zhēng)奪 的對(duì)象。
[0003] 我國(guó)是土壤鹽漬化嚴(yán)重的國(guó)家之一，鹽漬化土壤總面積達(dá)3460萬(wàn)公頃，相當(dāng)于耕 地的1 / 3,鑒于人多地少的特點(diǎn)，這些鹽漬化土壤仍被人們所利用栽種耐鹽作物，同時(shí)，早 春和晚秋的倒春寒每年也造成農(nóng)作物巨大損失。目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)微生物農(nóng)藥由于生防菌都 來(lái)源于陸地，在含鹽量較高的土壤中難以存活、定殖，在鹽漬地土傳病害的防治效果較差； 陸地生防菌由于生境原因，較低的環(huán)境溫度限制了其發(fā)揮作用。近幾年受到國(guó)內(nèi)外關(guān)注的 新資源-海洋微生物，由于其原始生境的低溫高鹽特性，使其更易在鹽漬土壤和低溫環(huán)境 發(fā)揮作用，在新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域顯現(xiàn)其生境優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一株在防治植物病害的同時(shí)又可誘導(dǎo)植物抗鹽，促進(jìn)植物生長(zhǎng) 的海洋芽孢桿菌，及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。發(fā)明充分利用了海洋微生物這一特殊生境的天然資 源，野生菌株已通過(guò)人工誘變育種，生物學(xué)特性和農(nóng)藥活性穩(wěn)定，容易培養(yǎng)，培養(yǎng)周期短，操 作方法簡(jiǎn)便可行，對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，所用原料廉價(jià)，生產(chǎn)成本低，開(kāi)發(fā)前景好，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè) 化。
[0005] 本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，由海洋生境獲得了海洋芽孢桿菌 BY-1188菌株（Bacillus marinus)，經(jīng)人工誘變育種和培養(yǎng)條件優(yōu)化，其適宜的人工培養(yǎng)發(fā) 酵的條件為：
[0006] 1)以其保藏編號(hào)為：CGMCC No. 6187的BY-1188菌株，菌株經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化測(cè)試， 其適宜的發(fā)酵培養(yǎng)液的配方為：蛋白胨2-5g，酵母粉l-3g，NaCl，25-30g，KC10. 3-0. 5g， MgCl2 · 7Η201· 9-2. 5g，F(xiàn)ePO40.0 1-0. 02g，水 1000ml，ρΗ7· 0-7. 5,上述為培養(yǎng)液，加瓊脂 16-19g為固體培養(yǎng)基；
[0007] 2)菌株在上述固體培養(yǎng)基置22°C -27°C溫箱培養(yǎng)2-3天，將固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)好的 菌體刮下，接入步驟1中的培養(yǎng)液培養(yǎng)3天為種子液，再將種子液接入40-50L上述培養(yǎng)液 中，22°C -27°C轉(zhuǎn)速150rpm，振蕩培養(yǎng)3-5天，獲得發(fā)酵液，并可逐級(jí)放大。
[0008] 所述的海洋芽孢桿菌BY-1188菌株菌落表面粗糙不透明，前期灰白色，后轉(zhuǎn)變?yōu)?濁紅色，邊緣缺刻狀，表面多褶；菌體呈直桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，0. 5-2. 5 μ mXl. 2-10 μ m， 無(wú)莢膜，周生鞭毛，芽孢中生不膨大，成對(duì)或鏈狀排列；生理生化特征：BY-1188菌株能在 5% NaCl的環(huán)境生長(zhǎng)，明膠酶試驗(yàn)陽(yáng)性，觸酶反應(yīng)陽(yáng)性，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，淀粉水解試驗(yàn)陰 性，VP試驗(yàn)陰性，吲哚反應(yīng)、H2S反應(yīng)陰性，氧化葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不利用檸檬酸鹽，不能水 解尿素和卵磷脂。
[0009] 所述的海洋芽孢桿菌BY-1188菌株采用對(duì)峙培養(yǎng)法、96孔板法、抑菌率統(tǒng)計(jì)法3種 抑菌測(cè)試聯(lián)合測(cè)試方法選出，菌株實(shí)用性強(qiáng)：
[0010] 1)對(duì)峙培養(yǎng)法、抑菌率統(tǒng)計(jì)法為常規(guī)方法,對(duì)農(nóng)業(yè)常見(jiàn)和危害嚴(yán)重的9種植物病 原真菌：稻癌霉菌Pyricularia oryzae、爺鏈抱菌Alternaria salani、鎌抱霉菌Fusarium oxysporrum、灰葡萄抱菌Botrytis cinerea、大_輪枝菌Verticillium dahliae、芽枝霉菌 Cladosporium fulvum、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、絲核菌Rhizoctonia solani 赤 霉菌Fusarium graminearum進(jìn)行抑菌測(cè)試，對(duì)峙培養(yǎng)法中抑菌圈30_35mm，抑菌率統(tǒng)計(jì)法 中抑菌率 73. 33-87. 60% ;
[0011] 2)96孔板為常規(guī)測(cè)試基礎(chǔ)上創(chuàng)制的改良方法，以發(fā)酵液直接測(cè)，測(cè)試單位為 yL/mL，供試祀標(biāo)病原菌為：稻癌霉菌Pyricularia oryzae和爺鏈孢菌Alternaria salani，供試靶標(biāo)病原菌孢子懸浮液以每孔50 μ L的量加入到96孔板的第1行各孔（A孔） 中，之后將海洋芽孢桿菌BY-1188菌株的無(wú)細(xì)胞濾液50 μ L，加入各孔混勻，并依次倍半稀 釋到第8行最后1孔（Η孔），以加無(wú)菌水的孔做為對(duì)照，27°C靜置培養(yǎng)3小時(shí)后觀察，觀測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)為：對(duì)照的病原菌孢子90%以上正常萌發(fā)，處理的病原菌孢子死亡或畸形率在90%以 上為抑制，每個(gè)處理重復(fù)3次，處理抑菌濃度越小，表示活性越高，BY-1188的抑菌活性MIC 為2,顯示強(qiáng)抑菌活性；
[0012] 所述的海洋芽孢桿菌BY-1188菌株在植物活體上對(duì)辣椒疫霉病、番茄灰霉病防治 效果分別為88. 4%和85. 1%，防治效果超過(guò)傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥防治水平。
[0013] 所述的海洋芽孢桿菌BY-1188菌株在普通耕作土及海濱鹽漬土栽種的黃瓜、番 茄、辣椒、甘藍(lán)、甜瓜、茄子均能正常定殖，浸根栽種5天后根、莖、葉的定殖數(shù)分別可達(dá) 5· 98Χ103、6· 24Χ103、3· 78X 103,定殖數(shù)可維持 15-20 天。
[0014] 所述的海洋芽孢桿菌BY-1188菌株對(duì)植物種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)都具有促進(jìn) 作用，菌液處理的番茄植株苗健壯，葉片大，葉色濃綠，莖桿粗，根毛長(zhǎng)，幼苗的株高、根長(zhǎng)、 莖粗分別增加65. 0% -84. 4% ;葉綠素 a、b、總?cè)~綠素分別提高60. 0%，-143. 9%，植株鮮 重、干重增加86. 0% -115. 8%。
[0015] 所述的海洋芽孢桿菌BY-1188菌株在鹽漬土壤誘導(dǎo)植物抗鹽，菌株降低了根、葉 Na+的積聚39. 5 %，提高根、葉K+含量36. 09 %，植株含水量提高73. 66 %，植株鹽害癥狀減 輕，鹽害指數(shù)降低了 56. 67%。
[0016] 本發(fā)明有益效果：充分利用了海洋微生物這一特殊生境的天然資源，野生菌株已 通過(guò)人工誘變育種，生物學(xué)特性和農(nóng)藥活性穩(wěn)定，容易培養(yǎng)，培養(yǎng)周期短，操作方法簡(jiǎn)便可 行，對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，海洋芽孢桿菌活菌無(wú)論在植物離體還是活體情況下，都對(duì)植物病原真 菌有強(qiáng)抑制作用，菌株可在植物的根莖部及植物體內(nèi)正常定殖，在防治植物病害的同時(shí)，還 可促進(jìn)植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物抗鹽，所用原料廉價(jià)，生產(chǎn)成本低，開(kāi)發(fā)前景好，容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè) 化。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例中，本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下：
[0018] 實(shí)施例1 :BY-1188菌株的人工培養(yǎng)及發(fā)酵
[0019] 以保藏編號(hào)為：CGMCC No. 6187的BY-1188菌株，經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化測(cè)試，其適 合的培養(yǎng)發(fā)酵液的配方為：蛋白胨2-5g，酵母粉l-3g，NaCl，25-30g，KC10. 3-0. 5g， MgCl2 · 7Η201· 9-2. 5g，F(xiàn)ePO40.0 1-0. 02g，水 1000ml，ρΗ7· 0-7. 5,上述為培養(yǎng)液，加瓊脂 16-19g為固體培養(yǎng)基。
[0020] 在上述固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并用常規(guī)方法測(cè)試其理化特征，該菌株的菌落及菌體 特征：菌落表面粗糙不透明，前期灰白色，后