一種提高脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程和再生醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種提高脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 為涎腺腺泡樣細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細(xì)胞分化是組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研宄的熱點(diǎn)之一，目前，關(guān)于脂肪來(lái)源 干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為腺泡樣細(xì)胞的研宄報(bào)道極少，干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化主要存在的問(wèn)題是，短時(shí)間干 細(xì)胞轉(zhuǎn)分化效率很低，僅為13% -18%，限制了廣泛開(kāi)展干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為腺泡樣細(xì)胞的研 宄和應(yīng)用。因此，需要尋找一種干細(xì)胞高效轉(zhuǎn)分化的技術(shù)方法，促進(jìn)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為腺泡樣 細(xì)胞在損傷涎腺再生和修復(fù)方面的研宄和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種提高脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)分 化為涎腺腺泡樣細(xì)胞的方法，可實(shí)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞向涎腺腺泡樣細(xì)胞的高效率轉(zhuǎn)分化。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0005] 一種提高脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞的方法，采用消化法分別培養(yǎng)涎腺 細(xì)胞和脂肪來(lái)源干細(xì)胞，并制備富血小板纖維蛋白（PRF)浸提液，將所述涎腺細(xì)胞和脂肪 來(lái)源干細(xì)胞用transwell培養(yǎng)小室進(jìn)行共培養(yǎng)，上室接種涎腺細(xì)胞，下室接種脂肪來(lái)源干 細(xì)胞，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含體積濃度10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并添加所制備的富血小板 纖維蛋白（PRF)浸提液，誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞。
[0006] 其中，所述涎腺細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程如下：
[0007] 無(wú)菌條件下取C3H小鼠雙側(cè)頒下腺，用體積濃度0. 1 %的II型膠原酶消化獲得涎 腺細(xì)胞，體外培養(yǎng)，培養(yǎng)基主要成分：DMHM培養(yǎng)基，添加體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，IOOu/ ml的青霉素和鏈霉素，0.1 y g/mL的表皮生長(zhǎng)因子，5. 0 μ g/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白，5. 0 μ g/mL的胰 島素，〇. 4 μ g/mL氫化可的松。
[0008] 所述脂肪來(lái)源干細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程如下：
[0009] 無(wú)菌條件下取C3H小鼠雙側(cè)腹股溝脂肪，用體積濃度0. 1%的I型膠原酶消化獲 得脂肪干細(xì)胞，體外培養(yǎng)，培養(yǎng)基主要成分：DMHM培養(yǎng)基，添加體積分?jǐn)?shù)為10 %的胎牛血 清，100u/ml的青霉素和鏈霉素。
[0010] 所述富血小板纖維蛋白（PRF)浸提液的制備過(guò)程如下：
[0011] 抽取兔耳中動(dòng)脈血，3000rpm，離心10min，獲取PRF凝膠，冷凍干燥，按25mgPRF顆 粒/ImL無(wú)血清培養(yǎng)基的比例制備浸提液，置于37°C溫度條件下，浸提3天后離心，取上清培 養(yǎng)基，過(guò)濾除菌即得。
[0012] 所述transwell培養(yǎng)小室底面膜孔徑為0. 4 μ m，置于24孔板或6孔板中，建立共 培養(yǎng)系統(tǒng)。
[0013] 所述共培養(yǎng)過(guò)程中，涎腺細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞的數(shù)目比為4:1，采用含體積分?jǐn)?shù)為 10 %的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5% -5 %的富血小板纖維蛋白（PRF) 浸提液。
[0014] 本發(fā)明中，涎腺細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞來(lái)源于同一小鼠。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0016] (1)涎腺細(xì)胞培養(yǎng)基采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基并添加多種成分：表皮生長(zhǎng) 因子，轉(zhuǎn)鐵蛋白，胰島素和氫化可的松，能夠保持涎腺細(xì)胞維持良好功能狀態(tài)，分泌相關(guān)細(xì) 胞因子，促使干細(xì)胞向腺泡樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。
[0017] (2)涎腺細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基并添加 一定濃度的PRF浸提液，該共培養(yǎng)系統(tǒng)組成簡(jiǎn)單，使用方便。
[0018] (3) PRF浸體液含有多種生長(zhǎng)因子，能夠保持涎腺細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞活性，促進(jìn)干 細(xì)胞向腺泡樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，短期轉(zhuǎn)分化效率高達(dá)36. 2%，顯著優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道。
[0019] 本發(fā)明轉(zhuǎn)分化方法同樣適用于人類或其他動(dòng)物干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為本發(fā)明使用的共培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖。
[0021] 圖2為本發(fā)明共培養(yǎng)干細(xì)胞α -淀粉酶免疫熒光染色X200的電鏡圖片（A涎腺細(xì) 胞陽(yáng)性對(duì)照，B為未誘導(dǎo)干細(xì)胞組，C為正常誘導(dǎo)組，D為0. 5% PRF浸提液組，E為1% PRF 浸提液組，F(xiàn)為5% PRF浸提液組）。
[0022] 圖3為本發(fā)明共培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化率比較示意圖（與正常誘導(dǎo)組比較，*表 示 P < 0· 01) 〇
[0023] 圖4為本發(fā)明共培養(yǎng)干細(xì)胞α -淀粉酶Western Blot檢測(cè)示意圖（1-6分別代表 正常誘導(dǎo)組、0. 5% PRF浸提液組、1% PRF浸提液組、5% PRF浸提液組、下頒下腺細(xì)胞組和 未誘導(dǎo)組）。
[0024] 圖5為本發(fā)明共培養(yǎng)干細(xì)胞α -淀粉酶條帶灰度值分析示意圖（與正常誘導(dǎo)組相 比，* 表示 P < 〇· 05 ;*** 表示 P < 0· 001)。
[0025] 圖6為本發(fā)明共培養(yǎng)干細(xì)胞α -淀粉酶表達(dá)量分析示意圖（與正常誘導(dǎo)組相比， * 表示 P < 〇· 01)。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式。
[0027] 本發(fā)明一種提高脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為涎腺腺泡樣細(xì)胞的方法，包括如下步驟：
[0028] 1.涎腺細(xì)胞的培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取C3H小鼠雙側(cè)頒下腺，用0. 1 %的II型膠原酶 消化獲得涎腺細(xì)胞，體外培養(yǎng)。培養(yǎng)基主要成分：DMEM培養(yǎng)基，10 %胎牛血清，1 %雙抗， 0. 1 μ g/mL的表皮生長(zhǎng)因子，5. 0 μ g/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白，5. 0 μ g/mL的胰島素，0. 4 μ g/mL氫化 可的松。
[0029] 2.脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取C3H小鼠雙側(cè)腹股溝脂肪，用0. 1%的I型膠 原酶消化獲得脂肪干細(xì)胞，體外培養(yǎng)。培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，100u/ml的青 霉素和鏈霉素。
[0030] 3.富血小板纖維蛋白（PRF)浸提液的制備：抽取兔耳中動(dòng)脈血，3000rpm，離心 lOmin。獲取PRF凝膠，冷凍干燥，按25mgPRF顆粒/ImL無(wú)血清培養(yǎng)基的比例制備浸提液， 置于37°C，浸提3天后離心，取上清培養(yǎng)基，過(guò)濾除菌備用。
[0031] 4.涎腺細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)
[0032] 利用底面膜孔徑為0. 4 μπι的Transwell小室11置于24孔板或6孔板14中，建 立共培養(yǎng)系統(tǒng)，如圖1所示，上層小室內(nèi)接種涎腺細(xì)胞13,下層孔板內(nèi)接種脂肪干細(xì)胞12， 涎腺細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞的數(shù)目比為4:1。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，添加 0. 5% -I. 5% PRF浸提液。共培養(yǎng)進(jìn)行7天后，應(yīng)用免疫熒光和免疫印跡方法檢測(cè)轉(zhuǎn)分化細(xì) 胞α -淀粉酶陽(yáng)性表達(dá)，用RT-PCR檢測(cè)α -淀粉酶mRNA陽(yáng)性表達(dá)（圖2-圖6)。依據(jù)免疫 熒光結(jié)果計(jì)算7天脂肪干細(xì)胞向涎腺腺泡樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的效率高達(dá)36. 2%。
[0033] 為驗(yàn)證本發(fā)明所述脂肪干細(xì)胞向涎腺腺泡樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化新方法的功效，進(jìn)行試驗(yàn) 如下：
[0034] 1.材料與方法
[0035] I. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0036] 4周齡SPF級(jí)C3H小鼠，雄性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合 格證：0247897。飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)凈化屏障內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 使用許可證號(hào)：SYXK (陜）2009-002。
[0037] 1. 2主要實(shí)驗(yàn)試劑及耗材
[0038] 低糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco,美國(guó)）；胎牛血清（Biowest，法國(guó)）；胰蛋白酶（國(guó)安生 物科技有限公司，中國(guó)西安）；I型和II型膠原酶（Sigma，美國(guó)）；胰島素（Sigma，美國(guó)）；表 皮生長(zhǎng)因子（PEPROTECH，美國(guó)）；氫化可的松（Sigma，美國(guó)）；轉(zhuǎn)鐵蛋白（Sigma，美國(guó)）；兔 抗小鼠 α-淀粉酶抗體（santacruz biotechnology，美國(guó)）；|3-actin-抗（康為世紀(jì)，中 國(guó)北京）；山羊抗鼠 IgG/FITC標(biāo)記二抗（中彬金橋，中國(guó)北京）；正常山羊血清封閉液（博 士德，中國(guó)武漢）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)(巴傲德，中國(guó)南京）；細(xì)胞裂解試劑 盒（碧云天，中國(guó)上海）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，中國(guó)上海）；聚丙烯酰胺凝膠 試劑盒（碧云天，中國(guó)上海）；PVDF膜（millipore，美國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）； 培養(yǎng)瓶（corning，美國(guó)）；培養(yǎng)皿（corning，美國(guó)）；6孔板，24孔板，96孔板（corning，美 國(guó)）；Transwell 小室（孔徑 0.4ym)(BD falcon，美國(guó)）
[0039] 1.3主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備
[0040] 超凈工作臺(tái)（BI0BASE，中國(guó)山東）；低速離心機(jī)（湘儀，中國(guó)湖南）；恒溫?fù)u 床（福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó)）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo,美國(guó)）；倒置顯微鏡 (Olympus，日本）；倒置焚光顯微鏡（Leica，德國(guó)）；實(shí)時(shí)定量PCR儀（Thermo,美國(guó)）
[0041] 1.4涎腺細(xì)胞的培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取C3H小鼠雙側(cè)頒下腺，去除附帶的筋膜，脂肪 等，PBS洗2遍，剪碎，0. 1 %的II型膠原酶消化30min，離心洗滌后，接種于培養(yǎng)皿。每3天 換液一次。培養(yǎng)基主要成分：DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，1 %雙抗，0. 1 μ g/mL的表皮生長(zhǎng) 因子，5. 0 μ g/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白，5. 0 μ g/mL的胰島素，0. 4 μ g/mL氫化可的松。
[0042] L 5脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)
[0043] 無(wú)菌條件下取C3H小鼠雙側(cè)腹股溝脂肪帶，去除附帶的筋膜，PBS洗2遍，剪碎， 0. 1%的I型膠原酶消化50min，離心洗滌后，接種于培養(yǎng)瓶。
[0044] 1.6富血小板纖維蛋白（PRF)浸提液的制備
[0045] 抽取兔耳中動(dòng)脈血，立即移入離心管，3000rpm，離心10min。離心完成后，分為三 層：上層為血漿，底層為紅細(xì)胞，中層即為PRF凝膠。將PRF凝膠取出，至于凍干機(jī)冷凍干 燥，完成后在無(wú)菌條件下用研缽將其研磨成小顆粒，_20°C密封保存。取保存的PRF顆粒，按 25mgPRF顆粒/ImL無(wú)血