一種神經干細胞的大規(guī)模制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種神經干細胞（neural stem cells,NSCs)的大規(guī)模制備方法，具體 涉及NSCs的分離、培養(yǎng)和干細胞純化及大規(guī)模擴增培養(yǎng)NSCs的方法及其在細胞移植、干細 胞培養(yǎng)、組織工程，再生醫(yī)學和藥學方面的應用。
【背景技術】
[0002] 干細胞是正常人體內存在的細胞群體，具有高度自我復制和高度的分化潛能。近 年來隨著干細胞研究的深入，人們發(fā)現利用干細胞可再生各種組織器官，如肝臟、胰腺、神 經組織、骨骼、肌腱等。
[0003] 因來源和分離的原因，現階段臨床應用的干細胞主要有成人骨髓間充質干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)和造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs)、人外周血干細胞、人胚胎來源的干細胞如肝干細胞和神經干細胞、臍帶血造 血干細胞及胎盤或臍帶間充質干細胞。
[0004] 干細胞可分為長期亞群和短期亞群，長期亞群具有無限的自我更新能力，在個體 中持續(xù)終生，短期亞群自我更新能力有限，如短期HSCs的自我更新能力僅維持8周左右；根 據分化功能不同，干細胞分為全能性干細胞、多能性干細胞和單能性干細胞，個體形成中最 早的干細胞為全能性干細胞，包括受精卵及胚泡的內細胞團。全能性干細胞進一步形成原 始的生殖干細胞及成體干/祖細胞，并最終分化形成各種組織干細胞(如NSCs、肝干細胞、 胰島干細胞等)。
[0005] 神經干細胞（nerve stem cells，HSCs)是來源于神經組織的干細胞或前體細胞。 有研究表明，神經干細胞可以分化為神經元、神經膠質細胞和造血細胞等多種細胞。
[0006] 現階段人胚胎神經組織的分離和培養(yǎng)主要是從健康孕婦8~20周孕齡的胎兒， 無菌條件下分離胚胎神經組織，制備成細胞懸液后接種于含有堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF)、表皮生長因子（EGF)和B27因子的無血清培養(yǎng)液中，接種密度為IX IO5Ail。生長 為神經細胞球后，用胰酶進行傳代，接種密度為（7. 5~10) XlOVml ;再次長成神經細胞球 后用于移植手術。此制備方法可有效地從胎兒神經組織中分離到NSCs，但其缺點是一次只 能從胎兒神經組織中最多分離到IO9的神經細胞，經培養(yǎng)后NSCs的數量僅為108。用原始的 方法提取的神經干細胞，只能用于1-2個病人，加之胎腦來源有限，很大程度上限制了 NSCs 的臨床推廣應用。
[0007] NSCs來源與擴增困難是限制其成為藥物研發(fā)的主要障礙。
[0008] 名稱為"一種神經干細胞制劑、其制備方法及其用途"的發(fā)明專利申請(專利號： ZL02100859. 0,授權公告號：CN1194086C)揭示了一種神經干細胞制劑的制備方法，該方法 采用人胚胎腦組織用消化液消化后加入培養(yǎng)基中止消化，離心后機械吹打為單細胞懸液， 加入培養(yǎng)基，在C02、37°C下經過體外培養(yǎng)，篩選出神經干細胞球，即得到神經干細胞。分離 培養(yǎng)的神經干細胞，在體外傳3-6代，并在傳代過程中純化神經干細胞，得到的神經干細胞 制劑。但是，該方法應用剪碎法加酶消化法提取的神經干細胞，細胞數僅為1〇7個胎腦，如 按平均每例使用5X107個神經干細胞計算，只能用于1-2個病人，難以進行神經干細胞的 新藥研究和臨床應用需求。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供了一種神經干細胞的大規(guī)模制備方法。
[0010] 本發(fā)明所述的規(guī)模化制備神經干細胞的方法，包括以下步驟：
[0011] A、幼年動物或胚胎腦組織，稱重，按1 :2加入0. 1M/L磷酸鹽緩沖液（PBS)，采用電 動機械法絞碎或勻漿；
[0012] B、離心，去上清，沉淀用10-100倍體積的0. 01%的膠原酶或胰酶37°C攪拌消化30 分鐘，離心，用0.1 M PBS洗滌1~3次；
[0013] C、用10-100倍體積的0.1 MPBS液將沉淀洗出，加膠原酶、蛋白酶K、DNase繼續(xù)攪 拌消化30分鐘，0.1 M PBS洗滌3次，沉淀用10-100倍體積的0.1 MPBS洗出上層懸浮細胞， 過濾，離心后取細胞懸液進行細胞計數；
[0014] D、取上述細胞按I X 105/ml進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，內加 bFGF、EGF 和牛血清白蛋白，當培養(yǎng)中神經干細胞生長為神經細胞球后，采用胰酶消化法收集神經干 細胞，傳代，接種密度為IX IO5Ail繼續(xù)培養(yǎng)；
[0015] E、進行大規(guī)模(擺瓶法、轉瓶法或發(fā)酵罐法）細胞擴增，同時保持細胞未分化；
[0016] F、當細胞擴增10-100倍后收集細胞，按1-2 XioVml進行細胞凍存，備用；
[0017] G、細胞復蘇后通過流式細胞和細胞培養(yǎng)檢測，符合神經干細胞的特征。
[0018] 根據本發(fā)明所述的神經干細胞的大規(guī)模制備方法的進一步特征，所述神經組織來 源是選自：靈長類、小鼠、大鼠、兔、狗、豬、牛、馬的幼年動物或胎兒動物的大腦、小腦、中腦 或脊髓。
[0019] 根據本發(fā)明所述的神經干細胞的大規(guī)模制備方法的進一步特征，所述步驟A中， 所述的機械法包括：電動法(組織絞碎機，研磨機和勻漿機等)，勻漿速度和處理時間由組織 勻漿液的均勻度和細胞存活率決定，不做具體規(guī)定。
[0020] 根據本發(fā)明所述的神經干細胞的大規(guī)模制備方法的進一步特征，所述步驟A中， 所述的加 PBS的比例為：PBS的重量：神經組織重量為1-100 :1之間的任一比例，優(yōu)選為10 : 1〇
[0021] 根據本發(fā)明所述的神經干細胞的大規(guī)模制備方法的進一步特征，所述步驟B中， 所述的膠原酶濃度可為〇. 001%-1%，根據所用膠原酶的活力單位決定，所消化的時間因溫度 不同可為1分鐘至48小時，由最后所得的細胞數和細胞活力決定，優(yōu)選0. 01%的II膠原酶 37 °C消化30分鐘。
[0022] 根據本發(fā)明所述的神經干細胞的大規(guī)模制備方法的進一步特征，所述步驟B中， 所述的胰酶濃度可為〇. 〇〇1%_1%，根據所用胰酶的活力單位決定，所消化的時間因溫度不同 可為1分鐘至48小時，由最后所得的細胞數和細胞活力決定，優(yōu)選0. 0125%的胰酶37°C消 化30分鐘。
[0023] 根據本發(fā)明所述的神經干細胞的大規(guī)模制備方法的進一步特征，所述步驟E中， 所述的方法為擺瓶法或轉瓶法培養(yǎng)，和內加或不加支持物(如磁株、膠原、明膠和瓊脂等有 型物）的擺瓶法或轉瓶法培養(yǎng)。
[0024] 根據本發(fā)明所述的神經干細胞的大規(guī)模制備方法的進一步特征，所述的擺瓶法 或轉瓶法主要是使神經干細胞處于懸浮狀態(tài)生長，加入膠原或明膠等有型物的濃度可為 〇%_1% ;擺瓶法的轉速為55-65次/分鐘。
[0025] 優(yōu)選地，膠原濃度為0. 01%，明膠的濃度為0. 005%。
[0026] 本發(fā)明還提供了將本發(fā)明所述方法制備的神經干細胞的用途，包括：用于制備治 療神經系統(tǒng)疾病如病毒性腦炎、腦萎縮、遺傳性小腦共濟失調、側索硬化、腦外傷、腦血管 病、帕金森氏病、老年性癡呆的藥物制劑，以及檢測診斷試劑的用途。
[0027] 本發(fā)明所述的神經干細胞的大規(guī)模制備方法是綜合采用電動勻漿法加酶促消化 法，從幼年動物或胎兒動物神經組織中提取神經干細胞（NSCs)，可明顯提高神經干細胞收 率，細胞數可達到1-10X IOicVlOg神經組織。本方法采用機械法與聯合酶法相結合的辦法， 分離的神經細胞數量成10倍的增加，加之擴增培養(yǎng)技術的改進，NSCs數量可達傳統(tǒng)方法的 10倍至1000倍，因此，本方法的成功實施，可為NSCs的臨床推廣應用打下堅實的基礎，并有 可能將其作為NSCs藥物進行開發(fā)研究。
【附圖說明】
[0028] 圖1是神經干細胞移植前后各組實驗動物行為學變化及腦梗死體積比較圖。
[0029] 圖2是腦組織外觀及HE染色圖。
【具體實施方式】
[0030] 發(fā)明人在多年干細胞的研究中發(fā)現，從胎鼠腦組織中可分離到NSCs，之后又從人 胎腦中分離到NSCs,但分離到的NSCs數量極小，難以滿足臨床需求，因此，NSCs的產量成 為了其大規(guī)模臨床應用的主要瓶頸。自2010年12月始，立項進行NSCs產量的研究，經多 次工藝改造后使神經細胞從原有的1〇7/次增加到現在1〇9_1(7次，經培養(yǎng)擴增后細胞數可達 IOich11/次，NSC細胞數量增加約10倍-1000倍；大大方便了臨床操作。
[0031] 經發(fā)明人反復探索，發(fā)現采用機械法（電動）可有效地從神經組織中分離NSCs， 經膠原酶和胰酶聯合攪拌消化，細胞數明顯增加，經15-20天的培養(yǎng)擴增，細胞總數可達 IOich11個/次，其中干細胞比例可達10-20%，此NSCs可低溫長期保存，大大方便了臨床操作。
[0032] 采用此方法分離，提取，培養(yǎng)擴增所得的細胞，細胞數量和質量穩(wěn)定，可能/可以 做為干細胞藥物進