桑樹過氧化物酶MmPOD.12及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及到一種桑樹過氧化物酶12基因克隆和其在 脅迫條件下的表達應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氧化物和抗氧化物在細胞內(nèi)的平衡對于細胞的功能、調(diào)節(jié)和適應各種生長條件是 極為重要的。活性氧（reactive oxygen species, R0S)是機體有氧代謝的一個有毒產(chǎn)物， 但也是細胞內(nèi)信號連接的介體，過量產(chǎn)生的活性氧可能會導致氧脅迫，使細胞發(fā)生不可修 復的損傷，最終導致細胞凋亡。已知各種逆境脅迫都可誘發(fā)細胞內(nèi)活性氧濃度的增加而導 致氧化脅迫所以植物抗逆性的形成常常與抗氧化系統(tǒng)活性的增強密切相關(guān)。
[0003] 植物在生長的過程中，會受到各種環(huán)境的脅迫（如干旱，水害，熱害，冷害，病蟲 害和重金屬離子等），這些逆境將導致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS)，ROS可以通過破壞核酸，氧化蛋白來影響細胞的功能，從而影響植物的正常 生長。環(huán)境脅迫引起的ROS的積累可以通過抗氧化酶系統(tǒng)來消除，植物體內(nèi)的抗氧化酶系 統(tǒng)主要由超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，S0D)、過氧化氫酶（catalase，CAT)、過 氧化物酶（peroxidase，POD)、抗壞血酸（ascorbicAcid，AsA)、谷脫甘肽（glu.tathione， GH)、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate perox. idase，APx)等構(gòu)成，植物抗脅迫能力的提高 可能與體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)有關(guān)。
[0004] 植物為保證其代謝機能的正常進行對本身ROS的傷害，具有適應調(diào)節(jié)和抵御的能 力，具體表現(xiàn)為在體內(nèi)存在著一套精細而又復雜的抗氧化系統(tǒng)，其主要特征是降低或破壞 抗氧化酶的活性或抗氧化物質(zhì)的含量，使ROS的代謝失衡。在正常條件下ROS在植物體內(nèi) 的產(chǎn)生和清除處于一種動態(tài)平衡，其濃度也維持在一個較低的水平，此時ROS不會損傷植 物體而顯示出獨特的生理作用。但在逆境條件下這種動態(tài)平衡遭到破壞，植物抗氧化系統(tǒng) 清除ROS的能力下降，大量積累的ROS對植物造成傷害。這種傷害一方面使ROS的產(chǎn)生加 快，另一方面破壞了以SOD為主的抗氧化系統(tǒng)，導致ROS進一步積累，使植物正常代謝遭到 破壞。為了清除R0S。植物會應激地產(chǎn)生有效的抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)。因此，逆境脅迫下 清除ROS的能力也會發(fā)生變化。
[0005] 過氧化物酶（POD)廣泛存在于植物體內(nèi)不同組織中，它作為活性較高的適應性 酶，能夠反映植物生長發(fā)育的特點、體內(nèi)代謝狀況以及對外界環(huán)境的適應性。POD的作用具 有雙重性，一方面，POD可在逆境或衰老初期表達，可清除H202,表現(xiàn)為保護效應，為細胞活 性氧保護酶系統(tǒng)的成員之一；另一方面，POD也可在逆境或衰老后期表達，參與活性氧的 生成、葉綠素的降解，并能引發(fā)膜脂過氧化作用，表現(xiàn)為傷害效應，是植物體衰老到一定階 段的產(chǎn)物，甚至可作為衰老指標。
[0006] 過氧化物酶（peroxidases. POD ;EC1. 11. I. X)是一大類催化各種底物發(fā)生氧化的 生物體保護酶類家族。其最佳底物為過氧化氫（H2O2),催化過氧化氫（H2O 2)轉(zhuǎn)變成水.解 除H2O2的毒害。它對H2O2的要求是非常專一的而對供氫體的要求則較為廣泛；酚類、胺類 化合物、某些雜環(huán)化合物和一些無機離子等都可以作為過氧化物酶的供氫體。根據(jù)結(jié)構(gòu)上 是否含有啞鐵血紅素.POD可以分為2種類型，含有砸鐵血紅素的POX是由單一肽鏈與1個 鐵卟啉輔基結(jié)合構(gòu)成的血紅蛋白。
[0007] IAA是植物體內(nèi)一種垂要的激素，早在1965年人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)POD參與了 IAA代謝 的過程。研宄表明POD具有催化IAA氧化脫羧的能力，但并不是所有的POD同工酶都具有 催化IAA氧化脫羧的能力。在眾多參與IAA氧化作用的POD中，對煙草的陰離子POD有著 比較深入的研宄。該酶足煙草中的一個主要POD的同工酶，它能在體外氧化IAA。
[0008] 過氧化物酶可以清除植物體內(nèi)尤其是葉綠體中的H2O2，從而提高植物對氧化脅迫 的耐受性。過氧化物酶在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應等生理過程中都發(fā)揮著非常重要的 作用，尤其是植物受到逆境脅迫時，過氧化物酶可以快速清除細胞中產(chǎn)生的過量H2O2，使細 胞免受活性氧毒害。
[0009] 逆境是指對植物生存與發(fā)育不利的各種環(huán)境因素的總稱。植物對逆境的抵抗和忍 耐能力叫植物抗逆性。研宄表明過氧化物酶在多種逆境中發(fā)揮重要作用，研宄發(fā)現(xiàn)在干旱 脅迫、空氣污染、微量元素缺乏、離子脅迫、過度光強、紫外照射以及鹽脅迫等逆境下，過氧 化物酶活性迅速增加，過氧化物酶的表達起到消除逆境脅迫產(chǎn)生的自由基的作用。
[0010] 我國是桑樹的起源中心，種質(zhì)資源極為豐富。經(jīng)過桑樹種質(zhì)資源及育種工作者幾 十年的努力，現(xiàn)在全國已收集保存有近3000份桑樹種質(zhì)資源，其中不少資源都具有果用價 值、藥用價值、經(jīng)濟價值等。我們用已克隆得到的魯桑品種（Morus multicaulis)育MP0D12 基因部分mRNA序列。通過生物信息學分析其序列特征。同時，利用熒光定量PCR的方法檢 測了 MP0D12在干旱、鹽、ABA、SA脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄水平的變化規(guī)律。通過對該基因的研宄， 使我們從分子水平了解到桑樹P0D12基因在不同脅迫條件下的表達情況

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種桑樹過氧化物酶MmPOD. 12及其應用，可以用于 桑樹中的過氧化物酶基因在環(huán)境脅迫下的表達調(diào)控。
[0012] 技術(shù)方案：桑樹過氧化物酶MmPOD. 12,序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0013] 編碼桑樹過氧化物酶MmPOD. 12的基因，序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 上述桑樹過氧化物酶MmPOD. 12在作為植物非生物脅迫表達標志物中的應用。
[0015] 所述非生物脅迫為干旱、高鹽ABA、或SA脅迫。
[0016] 所述植物為桑樹（Morus multicaulis)。
[0017] 上述編碼桑樹過氧化物酶MmPOD. 12的基因在作為植物非生物脅迫表達標志物中 的應用。
[0018] 有益效果：過氧化物酶可以清除植物體內(nèi)尤其是葉綠體中的H2O2，從而提高植物 對氧化脅迫的耐受性。過氧化物酶在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應等生理過程中都發(fā)揮著 非常重要的作用，尤其是植物受到逆境脅迫時，過氧化物酶可以快速清除細胞中產(chǎn)生的過 量H2O2，使細胞免受活性氧毒害。逆境是指對植物生存與發(fā)育不利的各種環(huán)境因素的總稱。 植物對逆境的抵抗和忍耐能力叫植物抗逆性。研宄表明過氧化物酶在多種逆境中發(fā)揮重要 作用，研宄發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫、空氣污染、微量元素缺乏、離子脅迫、過度光強、紫外照射以及 鹽脅迫等逆境下，過氧化物酶活性迅速增加，過氧化物酶的表達起到消除逆境脅迫產(chǎn)生的 自由基的作用。
[0019] 本發(fā)明所述桑樹過氧化物酶MmPOD. 12,完善桑樹基因組同時提供了桑樹過氧化物 酶在非生物脅迫條件的表達分析和應用。
【附圖說明】
[0020] 圖1為桑樹過氧化物酶MmPOD. 12基因的3' -RACE擴增結(jié)果圖：M. 2000bp DNA分 子標記I. RT-PCR產(chǎn)物；
[0021] 圖2為桑樹過氧化物酶MmPOD. 12基因的5' RACE擴增結(jié)果圖：M. 2000bp DNA分子 標記；IPCR擴增產(chǎn)物；
[0022] 圖3為桑樹過氧化物酶MmPOD. 12基因推導的氨基酸序列保守區(qū)預測軟件截圖；
[0023] 圖4為定量RT-PCR檢測MmPOD. 12基因在鹽脅迫下桑苗嫩葉中的相對表達量圖； 1.對照，2.鹽處理6小時，3.鹽處理12小時，4.鹽處理1天，5.鹽處理2天，6.鹽處理4 天，7.鹽處理16天；每組數(shù)據(jù)左側(cè)為鹽實驗處理結(jié)果，右側(cè)為對照組；
[0024] 圖5為定量RT-PCR檢測MmPOD. 12基因在干旱脅迫下桑苗嫩葉中的相對表達量 圖；1.對照，2.干旱處理2d，3.干旱處理4d，4.干旱處理8d，5.干旱處理10d，6.干旱處理 16d ;每組數(shù)據(jù)左側(cè)為干旱實驗處理組，右側(cè)為對照組；
[0025] 圖6為定量RT-PCR檢測MmPOD. 12基因在ABA脅迫下桑苗嫩葉中的相對表達量圖； 1.對照，2. ABA處理1小時，3. ABA處理2小時，4. ABA處理4小時，5. ABA處理6小時，6. ABA 處理8小時，7. ABA處理10小時，8. ABA處理1天，9. ABA處理2天，10. ABA處理3天；每組 數(shù)據(jù)左側(cè)為ABA實驗處理組，右側(cè)為對照組；
[0026] 圖7為定量RT-PCR檢測MmPOD. 12基因在SA脅迫下桑苗嫩葉中的相對表達量圖； 1.對照，2. SA處理1小時，3. SA處理2小時，4. SA處理4小時，5. SA處理6小時，6. SA處理 8小時，7. SA處理10小時，8. SA處理1天，9. SA處理2天，10. SA處理3天；每組數(shù)據(jù)左側(cè) 為SA實驗處理組，右側(cè)為對照組。
【具體實施方式】
[0027] 實施例1桑樹過氧化物酶MmPOD. 12基因的克隆
[0028] 供試桑樹品種為保存于中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研宄所國家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹圃的育 71-1。利用已獲得的包含桑樹過氧化物酶MmPOD. 12基因 cDNA片段的ESTs序列，設(shè)計引物， 并加以驗證，引物序列如下：
[0029] MmPOD. 12-F:5,-TAGATGCCACCGACACGGT-3，；
[0030] MmPOD. 12-R:5'-ACTTGGATTCCTAGCAGAGC-3' ；
[0031] 根據(jù)已克隆并驗證的基因中間片段結(jié)果，設(shè)計3'RACE擴增所需目的基因的上游 特異性引物，引物序列如下：
[0032] GSPl:5'-ACAAGAGCAGTAACTATAGCCAACC-3'
[0033] 根據(jù)已克隆3' RACE產(chǎn)物驗證序列結(jié)果，設(shè)計5RACE擴增所需目的基因的下游特異 性引物，引物序列如下：
[0034] GSP2 :5'-ATGACAGGGTCTTGGGTGGGATAGAG-3'
[0035] 根據(jù)已獲得的基因全長序列設(shè)計進行熒光定量分析的引物，引物序列如下：
[0036] qMmPOD. 12-F:5,-CCCCACGAACATCACGGTTGCCACTA-3'
[0037] qMmPOD. 12-R:5,-GCACGTATCTCACCTTGGCTGCCTGT-3'
[0038] 根據(jù)NCBI上查找的在桑樹中穩(wěn)定表達的β -actin基因 （GeneBank 登錄號：DQ785808)序列設(shè)計內(nèi)參基因的上下游引物，上游引物序列 β -actin-F 為 5'-AGCAACTGGGATGACATGGAGA-3' ，下游引物序列 β -actin-R 為 5,-CGACCACTGGCGTAAAGGGA-3, 。
[0039] 桑樹過氧化物酶MmPOD. 12基因中間cDNA片段的克隆
[0040] 以合成的cDNA第1鏈為模板，利用上述設(shè)計的RPS3a - F和RPS3a - R為引物進行 RT-PCR擴增。PCR擴增程序為：94°C預變性 5min ;94°C30s，56°C40s，72°C lmin，循環(huán) 35 次； 72°C延伸IOmin ;保存4°C。取3 μ L的RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段的 大小，檢測目的片段大小與預測大小是否相符（圖1)。符合后取45 μ L RT-PCR產(chǎn)物用TAE 緩沖液制作的1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，采用TaKaRa公司Agarose Gel DNA Purification Kit試劑盒進行目的片段的膠回收和純化。目的片段用DNA連接酶與pMD?18-T載體連接。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到宿主菌E. co