用于生產(chǎn)糖基化免疫球蛋白的方法
【專利說(shuō)明】用于生產(chǎn)糖基化免疫球蛋白的方法
[0001] 本申請(qǐng)為2010年10月25日提交的、發(fā)明名稱為"用于生產(chǎn)糖基化免疫球蛋白的 方法"的PCT申請(qǐng)PCT/EP2010/066073的分案申請(qǐng)，所述PCT申請(qǐng)進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的日期 為2012年4月26日，申請(qǐng)?zhí)枮?01080048412. 2。
[0002] 本文報(bào)道在細(xì)胞中生產(chǎn)免疫球蛋白的領(lǐng)域的方法，從而可以基于培養(yǎng)條件修飾所 生產(chǎn)的免疫球蛋白的糖基化模式。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 近年來(lái)免疫球蛋白的生產(chǎn)穩(wěn)定增加并且在不久的將來(lái)，免疫球蛋白可能將成為多 種疾病治療可用的治療法的最大組別。免疫球蛋白的影響源自其特異性，所述特異性包括 其特異性的靶識(shí)別和結(jié)合功能以及與抗原/Fe受體結(jié)合的同時(shí)或之后特定效應(yīng)的活化。
[0005] 特異性的靶識(shí)別和結(jié)合由免疫球蛋白的可變區(qū)介導(dǎo)。產(chǎn)生效應(yīng)的免疫球蛋白分子 的其他部分是翻譯后修飾，例如糖基化模式。翻譯后修飾對(duì)免疫球蛋白的效力、穩(wěn)定性、免 疫原性潛力、結(jié)合等確實(shí)具有影響。在此，必須提及依賴于補(bǔ)體的細(xì)胞毒性（CDC)、抗體依賴 性細(xì)胞毒作用（ADCC)和誘導(dǎo)凋亡。
[0006] 已報(bào)道免疫球蛋白的糖基化模式，即附著的糖基結(jié)構(gòu)的糖組成和數(shù)量對(duì)生物 學(xué)性質(zhì)具有強(qiáng)烈影響（參見例如 Jefferis，R· ,Biotechnol. Prog. 21(2005) 11-16)。由 哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的免疫球蛋白含有以質(zhì)量計(jì)2-3%的碳水化合物〇'&1^811(*1，1'. 等人，Biochem. 24(1985)5551-5557)。例如，在G類免疫球蛋白（IgG)中，這等價(jià) 于在小鼠來(lái)源的IgG中的2. 3個(gè)寡糖殘基（Mizuochi, T.等人，Arch. Biochem. Biophys. 257(1987)387-394)和在人來(lái)源的IgG中的2. 8個(gè)寡糖殘基（Parekh，R. 等人， Nature 316(1985)452-457)，其中一般地兩個(gè)位于Fe區(qū)而剩余的位于可變區(qū)（Saba, J. Α·等人，Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31)。
[0007] 在G類免疫球蛋白的Fe區(qū)中，能夠通過(guò)在297位的氨基酸殘基的N-糖基化引入 寡糖殘基，所述氨基酸殘基是天冬酰胺殘基（被標(biāo)注為Asn297)。Youings等人展示在15% 至20 %的多克隆IgG分子的Fab區(qū)中存在其他N-糖基化位點(diǎn)（Youings，A.等人，Biochem. J.，314(1996)621-630 ;還參見例如，Endo, T.等人，Mol. Immunol. 32(1995)931-940)。由 于非均一的（即不對(duì)稱的）寡糖加工，存在具有不同糖基化模式的免疫球蛋白的多種同 種型（Patel, T. P.等人，Biochem. J. 285(1992)839-845 ;Ip, C. C.等人，Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399 ;Lund, J.等人，Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748)。寡糖的 結(jié)構(gòu)和分布都同時(shí)是高度可重現(xiàn)的（即，非隨機(jī)的）和位點(diǎn)特異性的（Dwek，R. A.等人， J.Anat. 187(1995)279-292)。
[0008] 免疫球蛋白的一些特征與Fc區(qū)的糖基化直接相關(guān)（參見例如Dwek, R.A.等 人，J. Anat. 187 (1995) 279-292 ;Lund, J.等人，J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969 ; Lund, J. ,FASEB J. 9(1995)115-119 ； Wright,A.和 Morrison，S· L·，J· Immunol. 160 (1998) 3393-3402)，例如熱穩(wěn)定性和溶解性（West，C. M，Mol. Cell.Biochem.72 (1986) 3_20)、抗原性（Turco，S.J.，Arch.Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339)、免疫原性（Bradshaw，J.P.等人，Biochim.Biophys. Acta 847 (1985) 344-351 ;Feizi，T.和 Childs, R. A. ,Biochem.J. 245(1987) 1-11; Schauer, R.，Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72)、清除率 / 循環(huán)半壽期（Ashwell, G. 和 Harford, J.，Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554 ;McFarlane, I. G.，Clin. Sci. 64(1983) 127-135 ；Baenziger, J. U. , Am. J. Path. 121 (1985) 382-391 ；Chan, V. T.和 Wolf, G·，Biochem. J.247(1987)53_62;Wright，A.等人，Glycobiology 10 (2000) 1347-1355 ;Rifai, A.等人，J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182 ;Zukier, L. S.等人， Cancer Res. 58(1998)3905-3908)，和生物學(xué)比活性（JefTeris，R·和Lund, J·，in Antibody Engineering, Capra, J. D.編著，Chem. Tmmunol · Basel, Karger, 65 (1997) 111-128) 〇
[0009] 已研宄了影響糖基化模式的因子，例如發(fā)酵基質(zhì)中存在胎牛血清 (Gawlitzek，M.等人，J.Biotechnol.42(2) (1995) 117-131)、緩沖條件（MUthing，J. 等人，Biotechnol.Bioeng. 83(2003)321-334)、溶解氧濃度（Saba, J. Α·等人，Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31 ;Kunkel, J. Ρ·等人，J. Biotechnol. 62 (1998) 55-71 ;Lin, Α· Α·等 人，Biotechnol. Bioeng. 42 (1993) 339-350)、寡糖的位置和構(gòu)象以及宿主細(xì)胞類型和細(xì)胞 生長(zhǎng)狀態(tài)（Hahn, T. J.和 Goochee, C. F.，J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987 Jenkins, N. 等人，Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981)、細(xì)胞核苷酸-糖代謝（Hills, A. E.等人， Biotechnol.Bioeng. 75(2001)239-251)、養(yǎng)分限制（Gawlitzek, Μ.等人，Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544 ;Hayter，P.M.等人，Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335)， 特別地葡萄糖限制（Tachibana，H.等人，Cytotechnology 16(1994) 151-157)，和胞外 pH(Borys，M.C.等人，Bio/Technology 11(1993)720-724)。
[0010] 通過(guò)在例如NSO骨髓瘤細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白，已經(jīng)觀察到了增加的寡聚甘 露糖結(jié)構(gòu)以及截短的寡糖結(jié)構(gòu)（Ip, C. C.等人，Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399 ; Robinson, D. K.等人，Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735)。在葡萄糖饑餓 的條件下，已經(jīng)觀察到CHO細(xì)胞、鼠3T3細(xì)胞、大鼠肝細(xì)胞瘤細(xì)胞、大鼠腎細(xì)胞 和鼠骨髓瘤細(xì)胞中的糖基化變化，例如較小的前體寡糖的附著或完全缺少寡糖 部分（Rearick，J.I.等人，J. Biol. Chem. 256 (1981)6255-6261 ;Davidson，S. Κ·和 Hunt, L. A.，J. Gen. Virol. 66 (1985) 1457-1468 ;Gershman，H. *Robbins，P. W.，J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780 ;Baumann，H. *Jahreis，G.P.，J.Biol. Chem. 258 (1983) 3942-3949 ;Strube, K. -H.等人，J. Biol. Chem. 263 (1988) 3762-3771 ; Stark, N.J.和 Heath, E.C·，Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609)。Wong, D.C.F.等 人，Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 164-177報(bào)道了基于低谷氨酰胺/葡萄糖濃度的策略。
[0011] 日本專利申請(qǐng)JP 62-258252報(bào)道了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的灌注培養(yǎng)物，而US 5, 443, 968報(bào)道了用于分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞的補(bǔ)料-分批培養(yǎng)方法。在W098/41611中，報(bào)道了 使細(xì)胞適應(yīng)特征是低乳酸生產(chǎn)的代謝狀態(tài)的有效的細(xì)胞培養(yǎng)方法。WO 2004/048556中報(bào)道 了為了生產(chǎn)物質(zhì)而培養(yǎng)細(xì)胞的方法。Elbein, A. D.，Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534 報(bào) 道了當(dāng)在缺少葡萄糖的條件下孵育時(shí)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞將含有甘露糖-5的結(jié)構(gòu)而非含有甘 露糖-9 的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)。Takuma, S.等人，在 Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479-1488 中報(bào)道了在葡萄糖限制的過(guò)程中，PC02的依賴性對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和IgG生產(chǎn)的影響。
[0012] 歷
[0013] 已發(fā)現(xiàn)基于培養(yǎng)方法中向細(xì)胞提供的葡萄糖的量，能夠修改由真核細(xì)胞生產(chǎn)的多 肽的糖基化模式中甘露糖-5糖基結(jié)構(gòu)的量。通過(guò)降低可用的葡萄糖的量，例如通過(guò)將DGL 值從1.0 變?yōu)楦〉闹担ɡ?. 8、0. 6、0. 5、0. 4或0. 2)，能夠獲得糖基化模式中甘露糖-5 糖基結(jié)構(gòu)量的改變。DGL值或每時(shí)間單位可用的葡萄糖的量必須分別保持恒定和處于每時(shí) 間單位確定的降低的值。
[0014] 本文報(bào)道的第一個(gè)方面是在真核細(xì)胞中生產(chǎn)多肽（在一個(gè)實(shí)施方案中是免疫球 蛋白）的方法，所述方法包括下列步驟：
[0015] a)提供包含編碼多肽的核酸的真核細(xì)胞，
[0016] b)在這樣的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其中葡萄糖限制度（DGL)保持恒定且其中DGL少于 0· 8,和
[0017] c)從培養(yǎng)物中回收多肽，
[0018] 其中，具有甘露糖-5糖基結(jié)構(gòu)的多肽級(jí)分是包含具有甘露糖-5糖基結(jié)構(gòu)的多肽 的量、多肽G(O)同種型的量、多肽G(I)同種型的量和多肽G(2)同種型的量的總和的10% 或更少。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方案中，DGL在從0.8至0.2的范圍內(nèi)保持恒定。在其他實(shí)施方案中， DGL在從0. 6至0. 4的范圍內(nèi)保持恒定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有甘露糖-5糖基結(jié)構(gòu)的 多肽級(jí)分是包含具有甘露糖-5糖基結(jié)構(gòu)的多肽、多肽G(O)同種型、多肽G(I)同種型和多 肽G(2)同種型的總和的8%或更少。仍然在另一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是免疫球蛋白，在一個(gè) 實(shí)施方案中是G或E類的免疫球蛋白