基于環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)檢測禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性基因型f200y的方法及引物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)檢測禾谷鐮孢菌對 多菌靈抗性基因型F200Y菌株的方法及引物組合物；可用于禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性群體 發(fā)展的動態(tài)監(jiān)測與抗性風險評估，進行抗藥性小麥赤霉病的流行預(yù)測，為小麥赤霉病的防 治提供用藥指導。
【背景技術(shù)】
[0002] 由禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum)引起小麥赤霉病是一種分布較廣、破 壞性較強的世界性病害，在小麥的整個生長階段均可發(fā)生，可引起種腐、苗腐、莖腐、桿腐 和穗腐，其中以穗腐的危害和損失最大，該病菌能在感病的麥粒中產(chǎn)生多種衍生真菌毒 素及次生代謝物質(zhì)，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON)和雪腐鐮刀菌烯醇 (Nivalenol，NIV)等，嚴重降低小麥的品質(zhì)，并能引起人類和哺乳動物中毒，發(fā)生腹瀉、頭 暈、流產(chǎn)等急性毒性和干擾蛋白質(zhì)合成、免疫功能下降等慢性毒性，嚴重威脅著人和動物的 健康。多年來，小麥赤霉病主要采用以多菌靈為主的苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主 的復配劑進行化學防治。但是隨著使用年限和頻率的增長，田間逐漸產(chǎn)生了抗藥性群體， 從而導致該病防效下降。經(jīng)過多年的研宄，南京農(nóng)業(yè)大學周明國教授課題組發(fā)現(xiàn)小麥赤霉 病菌對多菌靈的抗藥性主要是由禾谷鐮孢菌β2_微管蛋白基因（FGSG_06611.3)突變造 成，該基因編碼第167位和200位氨基酸密碼子的突變分別為TTT(Phe) - TAT(Tyr)和 TTC (Phe) - TAC(Tyr)。
[0003] 病原菌在自然界的數(shù)量巨大，抗藥性個體在群體中的比例達到3%時，即可引起抗 藥性病害流行，導致藥劑防治失敗。傳統(tǒng)的抗性菌株的檢測方法主要是通過分離培養(yǎng)病原 菌，然后在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，根據(jù)藥劑對菌絲生長的抑制作用鑒別抗藥性，該方法檢測周 期長，從分離到鑒定長達1周，甚至數(shù)周，且在病原菌培養(yǎng)過程中存在雜菌污染。近年來，隨 著核酸相關(guān)分子檢測技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)為植物病原菌的抗藥性檢測提供了快速、靈敏、 準確的優(yōu)勢，但是檢測需要昂貴的實驗儀器及繁瑣的電泳過程，檢測時間較長，檢測成本高 昂，不能滿足快速檢測的需求，并且在鑒定過程中還需要接觸大量有毒有害試劑，對實驗操 作人員存在較大的安全隱患。
[0004] 環(huán)介導恒溫擴增反應(yīng)（LAMP)是日本學者Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸 體外擴增技術(shù)，廣泛應(yīng)用于動物、植物等疾病的基因診斷。該技術(shù)原理是：利用一套（4種） 特異性引物，在一種高活性鏈置換DNA聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應(yīng)，60~65°C 范圍30-80min內(nèi)，大量合成目標DNA的同時伴隨有副產(chǎn)物--白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。 羥基萘酚藍（HNB)是一種金屬離子指示劑，根據(jù)反應(yīng)液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)出不同的顏 色，陰性（沒有擴增出產(chǎn)物）時為紫色，陽性（有產(chǎn)物擴增）時為天藍色。LAMP方法的最大 特點就是實現(xiàn)恒溫擴增，不需要循環(huán)儀、凝膠成像系統(tǒng)等昂貴的儀器；擴增反應(yīng)極快，一般 在1小時內(nèi)完成；擴增產(chǎn)生的產(chǎn)物量大，通過肉眼即可判定結(jié)果，不需要繁瑣的電泳過程； 靈敏度高、特異性強；操作簡便、快捷，極適于病原突變基因型的快速鑒定及檢測。
[0005] 本發(fā)明在抗藥性機制研宄的基礎(chǔ)上，基于LAMP技術(shù)能快速、準確鑒定禾谷鐮孢菌 對多菌靈的抗性基因型F200Y。該鑒定方法具有簡單、快速、成本低，靈敏性高等特點，能大 大提高檢測效率，對小麥赤霉病的抗藥性治理、監(jiān)測及抗藥性流行預(yù)警具有重要的現(xiàn)實意 義。然而，經(jīng)檢索，該技術(shù)在植物病原菌抗藥性基因型的檢測報道很少，目前國內(nèi)外尚未有 禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性基因型F200Y的LAMP快速分子鑒定的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：針對已有禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性菌株的鑒定方法中存在費時、費力、 成本高、準確性低等缺點及PCR檢測技術(shù)需要昂貴的熱循環(huán)儀器和繁瑣的電泳操作過程， 無法快速檢測禾谷鐮孢菌的多菌靈抗性菌株，而提供一種禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性基因型 F200Y的新穎快速的分子檢測方法，對禾谷鐮孢菌的多菌靈抗性基因型F200Y進行LAMP檢 測，檢測周期短、準確性和靈敏度高、肉眼可以直接觀察檢測結(jié)果。
[0007] 技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] SEQ ID NO. 1所示的禾谷鐮孢菌含有200位點突變的β 2-微管蛋白基因序列作為 靶標在LAMP檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌中的應(yīng)用。
[0009] 用于檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP引物組合物：由SEQ ID NO. 2所示的正向內(nèi)引物FIP、SEQ ID NO. 3所示的反向內(nèi)引物BIP、SEQ ID NO. 4所示的正 向外引物F3、SEQ ID NO. 5所示的反向外引物B3組成。
[0010] 本發(fā)明所述的LAMP引物組合物在檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌中的 應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明所述的LAMP引物組合物在制備多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的 LAMP檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[0012] 一種檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP檢測試劑盒：包括ImL 檢測溶液，所述的檢測溶液包括：320U Bst DNA聚合酶，20mM Tris-HCl，IOmM KCl， 10mM(NH4)2S04,2mM MgS04,0. 1% Triton X-100,2.5mM MgCl2,0.8mM dNTPs，0.96M 甜菜堿， 0. 2mM羥基溴酚藍（HNB)，I. 0 μ M正向內(nèi)引物FIP，I. 0 μ M反向內(nèi)引物BIP，0. 25 μ M正向外 引物F3,0. 25 μ M反向外引物Β3,加入無菌超純水制備得到。
[0013] 所述的檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP試劑盒在檢測多菌靈抗 性基因型F200Y禾谷鐮孢菌中的應(yīng)用。
[0014] 一種檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP檢測方法：包括提取待檢禾 谷鐮孢菌的DNA，以提取的DNA為模板，利用LAMP檢測引物組合物或LAMP檢測試劑盒進行 LAMP擴增，擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結(jié)果，若存在梯狀條帶，則證明 所檢測禾谷鐮孢菌為多菌靈抗性基因型F200Y ;若無梯狀條帶，則證明所檢測禾谷鐮孢菌 為非多菌靈抗性基因型F200Y ;或觀察LAMP反應(yīng)溶液顏色變化，若為天藍色，判定為多菌靈 抗性基因型F200Y的禾谷鐮孢菌；若為紫色，判定為非多菌靈抗性基因型F200Y的禾谷鐮孢 菌。
[0015] 所述的檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP檢測方法：提取待檢禾谷 鐮孢菌的DNA，取1 μ L DNA溶液，加入10 μ L試劑盒中的檢測溶液進行LAMP，LAMP反應(yīng)參 數(shù)為 57 ~64°C，75 ~120min。
[0016] 本發(fā)明的檢測多菌靈抗性基因型F200Y禾谷鐮孢菌的LAMP檢測方法，包括提取待 檢禾谷鐮孢菌的DNA，以提取的DNA為模板，利用所述的LAMP引物組合物進行LAMP ;擴增產(chǎn) 物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結(jié)果（羥基溴酚藍不會影響電泳結(jié)果），若存在梯 狀條帶，則證明所檢測禾谷鐮孢菌為多菌靈抗性基因型F200Y ;羥基溴酚藍（HNB)屬于金屬 離子指示劑的一種。HNB是Mg2+的滴定劑，其顏色隨溶液pH變化而改變，因此可以通過監(jiān) 測LAMP反應(yīng)體系中Mg2+濃度的變化及溶液pH而起到顏色指示劑的作用。反應(yīng)前將HNB加 入到反應(yīng)液中，反應(yīng)體系呈紫色，反應(yīng)過程中Mg2+與LAMP反應(yīng)的副產(chǎn)物P 2074_結(jié)合產(chǎn)生大量 沉淀，溶液中Mg2+濃度降低，pH發(fā)生變化，從而使HNB的顏色由紫色變?yōu)樘焖{色。因此，反 應(yīng)結(jié)束后通過反應(yīng)體系的顏色變化，來判斷是否為禾谷鐮孢菌的多菌靈抗性基因型F200Y : 天藍色表示檢測為陽性，是禾谷鐮孢菌的多菌靈抗性基因型F200Y;紫色表示檢測結(jié)果為 陰性，是禾谷鐮孢菌的非多菌靈抗性基因型F200Y。
[0017] 本發(fā)明的關(guān)鍵性技術(shù)之一是根據(jù)禾谷鐮孢菌02微管蛋白200位氨基酸密碼子 TTC(Phe) - TAC(Tyr)的突變來設(shè)計和優(yōu)選出的高效特異擴增的引物序列及其擴增方法。 為了驗證能鑒定出禾谷鐮孢菌的多菌靈抗性基因型F200Y的特異性引物序列，本發(fā)明分別 選取禾谷鐮孢菌對多菌靈的敏感菌株、抗性基因型F167Y菌株、核盤菌和灰葡萄孢菌對多 菌靈的不同抗性基因型菌株為供試材料，采用CTAB法提取供試菌株的DNA。具體方法如 下：取少量菌絲，加800 μ L 2% CTAB提取液在球磨儀中研磨2min，加入等體積的苯酚-氯 仿-異戊醇（25 : 24 : 1)，顛倒混勻后，12000rpm離心10min;取上清于新離心管中，加入 2.5倍體積的無水乙醇，-20<€沉淀30111；[11，12000印1]1離心10111；[11 ;棄上清，沉淀用70%酒精 洗滌兩次，風干，加適量無菌蒸餾水溶解沉淀，4°C保存?zhèn)溆?。該DNA提取方法在Ih內(nèi)即可 提取到菌絲中的DNA。
[0018] 當LAMP進行反應(yīng)擴增時，產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂白色沉淀導致反應(yīng)液的池度上升， 通過HNB的顯色反應(yīng)結(jié)果所示，禾谷鐮孢菌的多菌靈抗性基因型F200Y反應(yīng)管均