反映空氣中可吸入顆粒物累積影響的唾液dna甲基化標志物與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)和生物健康監(jiān)測以及疾病預(yù)防技術(shù)領(lǐng) 域，涉及一種適合于家庭等場合應(yīng)用的健康監(jiān)測與環(huán)境風(fēng)險評估技術(shù)，特別地，涉及可用于 檢測空氣污染（如PM2. 5)對人體影響的基因甲基化位點。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)報道空氣中顆粒物質(zhì)（PM)的暴露與肺癌風(fēng)險的增加密切相關(guān)，實驗和流行病 學(xué)研宄表明，PM的質(zhì)量可能誘導(dǎo)癌變相關(guān)的生物學(xué)變化。空氣污染如PM是肺癌和心血管疾 病的重要誘因，對于個體在日常生活中受空氣污染影響的情況進行監(jiān)測與評價，對于提高 生活質(zhì)量、預(yù)防疾病具有重要的意義。許多基因被認為與肺癌有關(guān)，但還不是很清楚的是： 空氣污染如PM會影響到哪些基因，對受影響的基因有何作用。因此，有必要深入研宄空氣 污染如PM影響的基因以及其在基因水平的作用機制。
[0003] 基因可通過在胞嘧啶上甲基化來調(diào)控基因表達，尤其是啟動子區(qū)5' CpG島的甲 基化在人類癌癥的發(fā)展中已成為最重要的表觀遺傳機制之一。本領(lǐng)域中有多種方法檢測 DNA的甲基化。甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶-PCR/Southern (MSRE-PCR/Southern)方法是 利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶將DNA切割為大小不同的片段，并進行PCR/Southern分 析的方法。該方法是基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法。另還有基于經(jīng)重亞硫酸鹽處 理的，以及在此基礎(chǔ)上衍生出的一些甲基化分析方法，例如重亞硫酸鹽測序法（Bisulphite Sequencing)、甲基化特異性 PCR (methylation-specific PCR, MS-PCR)、焦磷酸測序 (Pyrosequencing)、結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法（combined bisulfiterestriction ana lysis, COBRA)等等。近年來涌現(xiàn)出不少基于全基因組的甲基化分析方法，也稱為甲基 化圖譜分析（methylation profiling)，該方法檢測樣本量大，可檢測多個位點。例如，基于 MassARRAY技術(shù)的飛行質(zhì)譜分析方法可實現(xiàn)多重CpG的檢測；基于高通量測序的分析方法； 以及基于芯片的甲基化圖譜分析：安捷倫的Human CpG Island Microarray Kit、Illumina 的 Infinium HumanMethylation27 BeadChip 芯片和 Infinium Human Methylation450 BeadChip芯片等等多種甲基化分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 目前，絕大部分對基因甲基化分析的研宄都是以血液樣品作為對象。由于需要對 個體進行多次采樣，為提高受試者的依從性，本發(fā)明沒有采用文獻中普遍使用的血細胞DNA 甲基化檢測，而是采用了取樣更為方便的唾液DNA甲基化檢測。唾液中含有鈉、鉀、鈣、鎂 等多種電解質(zhì)，糖蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶、唾液淀粉酶等各種蛋白質(zhì)，還有可從中獲得遺 傳信息的脫落口腔上皮細胞。唾液含有豐富的人體健康信息且易于獲取，因此相對傳統(tǒng)的 血液樣品，唾液是一個更為理想的便捷的樣品對象。DNA的甲基化并不是一成不變的，會在 環(huán)境因素、生活習(xí)慣，心理狀態(tài)等各種因素的影響下發(fā)生變化，且近期的研宄表明，唾液、血 液、精液等體液中的DNA甲基化差異非常大。因此，唾液的DNA甲基化變化可反映外界各種 因素對人體的影響。針對唾液進行相關(guān)甲基化研宄，獲取唾液中DNA甲基化標志物是非常 重要的。
[0005] 本發(fā)明對空氣中可吸入顆粒物與唾液中F2RL3基因甲基化之間的相關(guān)性進行評 估，同時找到一種分析唾液中DNA甲基化變化的新的檢測方法。而且，發(fā)明了一種評估空氣 污染如空氣中可吸入顆粒物對身體造成影響的評價方法。
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測空氣中可吸入顆粒物對人體影響的試劑盒，其利 用唾液作為檢測對象，能夠檢測唾液DNA中F2RL3基因的核苷酸區(qū)段的甲基化，所述F2RL3 基因的序列如SEQ ID NO :1所不。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述核苷酸區(qū)段在F2RL3基因 SEQ ID NO : 1中的位 置為1627~1832,具體序列如SEQ ID NO :2所示。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供的試劑盒用于檢測所述核苷酸區(qū)段在SEQ ID NO :1的 第1671、1682、1723、1758、1773、1791和1802位的七個CpG位點中任一位點的甲基化。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供的試劑盒，采用sequenom公司的飛行質(zhì)譜方法檢測 所述核苷酸區(qū)段的甲基化情況，并提供檢測所用的引物對。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供的引物對可以在嚴格條件下與SEQ ID NO :2的基因序 列雜交。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供的引物對的序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所 不O
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供的可以在嚴格條件下與SEQ ID NO :2的基因序列雜交 的引物對用于制備檢測空氣中可吸入顆粒物對人體影響的試劑盒的用途。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于用于制備檢測空氣中可吸入顆粒物對人體影響的試劑盒 的用途的引物對的序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示。
[0014] 本發(fā)明的方法有如下優(yōu)點：
[0015] 1.本方法采集的是唾液樣本，對人體無創(chuàng)傷，有利于對個體進行長期持續(xù)觀測。
[0016] 2.本發(fā)明選擇檢測的甲基化位點群與PM2. 5顯著相關(guān)，且分布于與吸煙緊密相關(guān) 基因 F2RL3上，可對人體受到的空氣小分子顆粒物傷害進行有效評估。
[0017] 3.本方法具有檢測方便，成本低廉、高通量的特點，適合推廣。
【附圖說明】
[0018] 參考隨附的附圖，本發(fā)明更多的目的、功能和優(yōu)點將通過本發(fā)明實施方式的如下 描述得以闡明，其中：
[0019] 圖1為每個受試者CpG2的DNA甲基化值以及對應(yīng)PM2. 5值的相關(guān)性示意圖。
[0020] 圖2為每個受試者CpG3的DNA甲基化值以及對應(yīng)PM2. 5值的相關(guān)性示意圖。
[0021] 圖3為每個受試者CpG4的DNA甲基化值以及對應(yīng)PM2. 5值的相關(guān)性示意圖。
[0022] 圖4為每個受試者CpG5的DNA甲基化值以及對應(yīng)PM2. 5值的相關(guān)性示意圖。
[0023] 圖5為每個受試者CpG6的DNA甲基化值以及對應(yīng)PM2. 5值的相關(guān)性示意圖。
[0024] 圖6為每個受試者CpG7的DNA甲基化值以及對應(yīng)PM2. 5值的相關(guān)性示意圖。
[0025] 圖7為所有受試者所有甲基化位點平均值以及對應(yīng)PM2. 5值的相關(guān)性示意圖。
[0026] 圖8為PM2. 5累積效應(yīng)對DNA甲基化的影響示意圖。
[0027] 圖9為監(jiān)測3天甲基化與前一段時間PM2. 5累積效應(yīng)的相關(guān)性示意圖。
[0028] 圖10為監(jiān)測2天甲基化與前一段時間PM2. 5累積效應(yīng)的相關(guān)性示意圖。
[0029] 圖11為監(jiān)測當(dāng)天甲基化與前一段時間PM2. 5累積效應(yīng)的相關(guān)性示意圖。
【具體實施方式】
[0030] 通過以下的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細解釋及展述， 使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠更加容易地理解本發(fā)明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明所述 主題的范圍僅限于以下的實例及限制本發(fā)明的任何或所有權(quán)利，更不應(yīng)該背離本發(fā)明的精 神。
[0031] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了空氣污染PM2. 5與F2RL3基因的甲基化有關(guān)?？諝馕廴救鏟M2. 5是 肺癌和心血管疾病的重要誘因，而F2RL3基因的甲基化本身是與吸煙密切基因。因此，發(fā)明 人推測，空氣污染如PM2. 5通過影響F2RL3基因的甲基化，從而進一步由所述基因的變化導(dǎo) 致某些疾病。F2RL3基因在NCBI中的編號為NC_000019. 10,位于第19號染色體上（基因 組版本：Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 2，GRCh38.p2)， 位置為 16889015 ~16892019。F2RL3 的基因序列如下（SEQ ID NO :1):
[0032]



[0036] 本發(fā)明選擇F2RL3基因進行甲基化檢測的核苷酸區(qū)段在F2RL3基因中的位置為 1627~1832 (如上述序列中下劃線所示），進行甲基化檢測的CpG位點分別位于核苷酸區(qū) 段的1671、1682、1723、1758、1773、1791、1802的七個位點（如下述序列中下劃線所示）。所 示核苷酸區(qū)段的具體序列如下：
[0037] cccaggccaagtctgtgccaatgacagtgacaccctggagctcccKgacagctcacKggcactgcttct gggctgggtgcccaccaggctggtgcc迎ccctctatgggctggtcctggtggtggggctgc弘gccaatgggctgg cgctgtgggtgctggccacgcaggcacctcggctgccctccaccatgetgetgatgaacc
[0038] (SEQ ID NO :2)
[0039] 實施例
[0040] 一：主要儀器與試劑
[0041] 基因擴增：ABI GeneAmp97OO 3別 Dual ;
[0042] 質(zhì)譜點樣：MassARRAY Nanodispenser RS1000 ;
[0043] 質(zhì)譜分析：MassARRAY Compact System ;
[0044] 試劑：EpiTYPERRT Complete Reagent Set
[0045] 二、SEQUENOM 甲基化檢測
[0046] 1.本發(fā)明選擇15名健康受試者，于每天晚上8點采集唾液，持續(xù)35天。
[0047] 2.引物設(shè)計及合成
[0048] 將待測序列輸入到EpiDesigner軟件，確定可檢測的區(qū)段，得到引物序列。采用 HPLC方法合成引物。引物序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示：
[0049] SEQ ID NO ： 3:AGGAAGAGAGGGTTTATTAGTAGTATGGTGGAGGG ；
[0050] SEQ ID NO ：4: