同時檢測多種動物源性成分的試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及同時檢測多種動物源性成分的試劑 盒及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 隨著市場經(jīng)濟的不斷發(fā)展，一些不法商販為了謀取不正當?shù)睦?，在血制品、肉?品中摻雜一些價格便宜的肉種甚至有掛羊頭賣狗肉的行為存在。有調(diào)查研宄表明，這種摻 假的現(xiàn)象在市場上已經(jīng)普遍存在，大部分肉制品中都摻有相對比較便宜的肉種，甚至全部 是價格便宜的肉種，這極大的損害了消費者的利益，擾亂了市場秩序，危害市民的健康。
[0003] 并且口蹄疫、瘋牛病、禽流感、羊瘙癢病等動物源傳染病頻發(fā)，疫情區(qū)域內(nèi)的動物 源性成分鑒別顯得尤為重要；為了防止疫情擴散，維護廣大消費者的切身利益，也需要一種 快速有效的動物源性監(jiān)測方法。
[0004] 但是，因血制品和肉類的同源性因此難以直接分辨，目前已有的動物源性成分鑒 別方法都存在一定的缺陷（顯微檢測方法：難以區(qū)分動物源性、免疫學(xué)檢測方法：工藝繁瑣 及靈敏特異性低、近紅外光譜檢測方法：需要大量有權(quán)威性的標準樣品、實時熒光定量檢測 方法通量低且容易出現(xiàn)假陽性)。目前檢測監(jiān)測機構(gòu)沒有一種快速有效的檢測方法，對肉制 品中的動物源性成分做出鑒定，致使此類現(xiàn)象難以判斷和裁決。為了規(guī)范市場秩序，維護消 費者的正當權(quán)力和利益，保證市場競爭的公正性，急需一種快速全面準確的檢測方法來判 斷此類現(xiàn)象。
[0005] 大腸桿菌是人和許多動物腸道中最主要且數(shù)量最多的一種細菌。其食品衛(wèi)生學(xué)意 義是作為食品是否被糞便污染的指示菌，廣泛被我國和國外許多國家應(yīng)用于食品衛(wèi)生質(zhì)量 檢驗。雖然腸道致病菌是引起食物中毒的主要來源，但由于大腸桿菌與致病菌的來源相同， 只要食品檢出大腸桿菌，說明有糞便污染，被認為不衛(wèi)生。本發(fā)明，包含11對不同動物來源 的特異性引物，并包含一對大腸桿菌引物作為血液、血制品及肉類，肉制品是否有糞便污染 的現(xiàn)象存在。
[0006] 專利201310082539. 1和201310368498. 2提供的檢測系統(tǒng)僅可檢測1種和4種肉 類源性，適用范圍有很大的限制。
[0007] 微衛(wèi)星（Microsatellite)，又稱簡單序列重復(fù)（Simple sequencerepeats, SSR)， 是指少數(shù)幾個核苷酸(一般為1-6個）為重復(fù)單位組成的簡單多次串聯(lián)重復(fù)序列，其長度大 多在IOObp以內(nèi)。由于微衛(wèi)星具有高度的多態(tài)性，在基因組中含量豐富且分布均勻等優(yōu)點， 而且微衛(wèi)星DNA所在區(qū)域在生物的基因組中是比較保守的，某一物種的微衛(wèi)星引物可在相 關(guān)密切的物種中使用，因此微衛(wèi)星標記技術(shù)的應(yīng)用非常廣泛。STR位點相對線粒體細胞色素 氧化酶b (Cytb)物種間的特異性更加好，擴增特異性較好，在樣本濃度高時，依然可以做到 特異性較高，避免了 Cytb序列物種間序列高度相似，無法復(fù)合擴增及高濃度樣本易出現(xiàn)假 陽性結(jié)果的缺陷。
[0008] 毛細管電泳檢測具很高的靈敏度，最低可檢測31-62. 85pg的基因組DNA，相當于 10-20個拷貝的人類基因組。并且可同時檢測的位點數(shù)量比實時熒光定量檢測多，通量更 尚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種同時檢測多種動物源性成分的試劑盒及其應(yīng)用，采用熒 光引物復(fù)擴和毛細管電泳方法結(jié)合，快速有效的對動物源性成分檢測，可以同時檢測犬、 牛、羊、魚、豬、鴨、雞、兔、貓、馬、鼠和大腸桿菌的動物源性成分。
[0010] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案： 在12種種屬的序列STR保守區(qū)域設(shè)計12對特異性引物分別擴增犬（PEZ1)、牛 (BM2113)、羊（MAF33)、魚（HLJ392)、豬（SW742)、鴨（CAUD056)、雞（MCW248)、兔（Sat7)、貓 (FCA955)、馬（HMS3)、鼠（cds)和大腸桿菌（CFS073)，檢測樣本DNA中是否含有這12種種屬 的DNA，實現(xiàn)同時鑒別樣本多種動物源性成分的目的。
[0011] 同時檢測多種動物源性成分的試劑盒，該試劑盒包括12對用于檢測動物源性成 分的引物，所述特異性引物由犬（PEZ1)、牛（BM2113)、羊（MAF33)、魚（HLJ392)、豬（SW742)、 鴨（CAUD056)、雞（MCW248)、兔（Sat7)、貓（FCA955)、馬（HMS3)、鼠（cds)和大腸桿菌 (CFS073)的特異性引物組成，所述引物序列及其濃度見表1。
[0012] 表1引物序列及濃度
所述的引物中至少有一個引物的5'端進行熒光染料標記。
[0013] 優(yōu)選的，所述的每個基因座對應(yīng)的引物中至少有一個引物的5'端進行熒光染料標 記。
[0014] 優(yōu)選的，將所述12個物種分組，具體為：第一組羊（MAF33)、魚（HLJ392)、豬 (SW742 )、雞（MCW248 )、大腸桿菌（CFT073 )、犬（PEZ1) ;第二組鴨（CAUD056)、鼠（cds)、兔（Sat7)、牛（BM2113)、馬（HMS3)、貓（FCA955); 每組引物采用藍色熒光染料6-FAM、綠色熒光染料HEX、黃色熒光染料TAMRA或紅色熒 光染料ROX中任一種進行標記，且各組之間的標記色均不相同；內(nèi)標選用橙色熒光標記，標 記物為SIZ。
[0015] 所述試劑盒的擴增體系如表2 : 表2 PCR加樣體系
其中所述的 Reaction Mix 為MgCl2 7. 5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7. 5mM，BSA 2mg/ml。其中DNA模版為待檢測樣品中提取的DNA，樣品來源可為肉、肉制品、 血、血制品。
[0016] 復(fù)合擴增引物之間存在相互干擾，比如不同基因座引物形成二級結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生非特 異擴增。復(fù)合擴增引物測試的加樣體系如表2,擴增體系如表2。經(jīng)過引物篩選之后最終確 定了引物序列及引物濃度，如表1，引物擴增效率高，相互之間無非特異擴增。
[0017] 所述的試劑盒在檢測動物源性成分中的應(yīng)用，包括如下步驟： 1) 、取待檢測樣品，進行DNA的提取，提取的DNA作為DNA模版，樣品來源可為肉、肉制 品、血、血制品， 2) 按表1中的引物及濃度配置引物混合物，PCR加樣體系如表2 ; 3) 將PCR擴增管置于熱循環(huán)儀上，選擇表3所示的擴增程序進行擴增；擴增后的樣品 應(yīng)避光保存； 表3熱循環(huán)儀的擴增程序
4) 擴增產(chǎn)物在遺傳分析儀上熒光檢測 由去離子甲酰胺與系統(tǒng)中分子量內(nèi)標AG⑶Marker SIZ-500組成上樣混合物〔（0. 5μ1 AG⑶Marker SIZ-500 (無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司））X (進樣數(shù)）+ (12μ1去離子 甲酰胺）X (進樣數(shù))〕。將12. 5μ1上樣混合物與PCR產(chǎn)物，避免產(chǎn)生氣泡。95°C變性3分 鐘，冰浴3分鐘，并盡快電泳；用遺傳分析儀檢測分析； 用片段分析軟件GeneMapper分析步驟4)中遺傳分析儀檢測收集的數(shù)據(jù)。
[0018] 電泳采用多道或單道毛細管電泳。軟件分析峰高高于50rfu，認為相應(yīng)的基因有擴 增。反之，分析結(jié)果峰高低于50rfu，認為無擴增，即不含相應(yīng)的基因。
[0019] 有益效果： 1、本發(fā)明提供的同時檢測多種動物源性成分的試劑盒，可以同時檢測犬（PEZ1)、牛 (BM2113)、羊（MAF33)、魚（HLJ392)、豬（SW742)、鴨（CAUD056)、雞（MCW248)、兔（Sat7)、貓 (FCA955)、馬（HMS3)、鼠（cds)動物源性成分，在一次擴增、可以檢測出是否血液，血制品， 肉類和肉類品來源。
[0020] 2、復(fù)擴體系中添加的大腸桿菌（CFS073)引物可以作為制品是否存在糞便污染的 指示。
[0021] 3、選用11種物種的STR位點，避免了各物種間線粒體基因由于序列相似，實時熒 光定量PCR高濃度樣本檢測帶來的假陽性結(jié)果。本發(fā)明20ng模版DNA擴增除目的峰以外 無非特異擴增。同時靈敏度較好，50pg模版DNA能夠檢出。
【附圖說明】
[0022] 圖1為鴨提取DNA擴增結(jié)果，只有CAUD056基因座有擴增，其余無擴增。
[0023] 圖2為羊提取DNA擴增結(jié)果，只有MAF33基因座有擴增，其余無擴增。
[0024] 圖3為魚提取DNA擴增結(jié)果，只有HLJ392基因座有擴增，其余無擴增。
[0025] 圖4為豬提取DNA擴增結(jié)果，只有SW742基因座有擴增，其余無擴增。
[0026] 圖5為雞提取DNA擴增結(jié)果，只有MCW248基因座有擴增，其余無擴增。
[0027] 圖6為大腸桿菌菌液擴增結(jié)果，只有CFS073基因座有擴增，其余無擴增。
[0028] 圖7為馬提取DNA擴增結(jié)果，只有HMS3基因座有擴增，其余無擴增。
[0029] 圖8為貓?zhí)崛NA擴增結(jié)果，只有FCA955基因座有擴增，其余無擴增。
[0030] 圖9為牛提取DNA擴增結(jié)果，只有BM2113基因座有擴增，其余無擴增。
[0031] 圖10為犬提取DNA擴增結(jié)果，只有PEZl基因座有擴增，其余無擴增。
[0032] 圖11為鼠提取DNA擴增結(jié)果，只有cds基因座有擴增，其余無擴增。
[0033] 圖12為兔提取DNA擴增結(jié)果，只有Sat7基因座有擴增，其余無擴增。
[0034] 圖1~12中第三行峰為分子量marker AG⑶SIZ-500的峰，由無錫中德美聯(lián)生物