阿司匹林抵抗相關(guān)的GPⅠa基因多態(tài)性位點(diǎn)及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)疾病治療藥物選擇領(lǐng)域，具體涉及阿司匹林抵抗相關(guān)的GP I a 基因多態(tài)性位點(diǎn)及應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 隨著我國人口老齡化，腦血管病發(fā)病率逐年攀升，最新調(diào)查結(jié)果表明從2010年起 腦血管病已成為超越腫瘤危害中國人健康的第一大殺手，每年我國新發(fā)病例200萬，缺血 性腦血管病占70~80%，復(fù)發(fā)患者占27%，70%的患者留有神經(jīng)功能缺損，腦血管病的高 致死率、致殘率和復(fù)發(fā)率已造成了極大的社會(huì)負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?？寡“逅幬铮ㄓ绕涫前?司匹林）在腦血管病的防治中起著至關(guān)重要的作用，但是目前的調(diào)查結(jié)果表明很多腦血管 病患者即使服用了抗血小板藥物，仍然反復(fù)再發(fā)卒中，這種現(xiàn)象稱為抗血小板藥物抵抗。
[0003] 抗血小板藥物抵抗與諸多因素相關(guān)，如腦血管病相關(guān)危險(xiǎn)因素（性別、糖尿病、吸 煙、代謝綜合征、急性冠脈綜合征、既往心血管事件、肝腎功能異常、血液系統(tǒng)疾病等），患者 依從性或藥物劑量，藥物相互作用及基因多態(tài)性等。其中基因多態(tài)性是目前研宄熱點(diǎn)。既 往研宄發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)影響阿司匹林作用的多個(gè)環(huán)節(jié)的因子存在基因多態(tài)性，這種多態(tài)性直 接影響其功能，從而使得不同個(gè)體服用阿司匹林后對(duì)血小板的反應(yīng)不同。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，臨 床阿司匹林抵抗的患者高達(dá)40%，但是因?yàn)橛绊懓⑺酒チ肿饔玫陌悬c(diǎn)眾多，到目前為止，阿 司匹林抵抗相關(guān)的基因多態(tài)性還不確定。但是阿司匹林作為缺血性腦血管疾病二級(jí)預(yù)防的 重要藥物，盡快明確阿司匹林抵抗相關(guān)基因多態(tài)性至關(guān)重要。
[0004] 血小板膜糖蛋白GP I a是血小板主要的膠原受體，屬整合素家族，在血小板聚集 和粘附中起主要作用。當(dāng)患者血管內(nèi)皮損傷，內(nèi)皮下膠原暴露，血小板即通過GP I a粘附 到血管內(nèi)皮下暴露的膠原上，活化血小板，參與血栓形成?；谏暾?qǐng)人最近的研宄，申請(qǐng)人 明確了一個(gè)與阿司匹林抵抗相關(guān)的GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)：GP I a(C807T)，該位點(diǎn)可用 于為缺血性卒中患者選擇抗血小板藥物，降低阿司匹林抵抗及卒中復(fù)發(fā)率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供了阿司匹林抵抗相關(guān)的GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)：C807T。 該位點(diǎn)位于人GP I a基因全長的第807位，其堿基為C或T，攜帶有GP I a突變體807T 等位基因的患者與野生型C807患者相比，更易出現(xiàn)阿司匹林抵抗。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了檢測(cè)阿司匹林抵抗相關(guān)GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn) C807T的引物。
[0007] 本發(fā)明最后一個(gè)目的在于提供了基于GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)C807T的引物在制 備篩選阿司匹林抵抗患者試劑盒中的應(yīng)用。該試劑盒可用于篩選阿司匹林抵抗患者，以便 更好的為缺血性卒中患者選擇抗血小板藥物，降低阿司匹林抵抗及卒中復(fù)發(fā)率。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0009] 與阿司匹林抵抗相關(guān)的GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)，該位點(diǎn)是在人GP I a基因的 807位發(fā)生了 C - T的突變，經(jīng)檢測(cè)攜帶有GP I a突變體807T的患者更容易發(fā)生阿司匹 林抵抗?；贕P I a基因的第807位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，然后對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
[0010] 本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容還包括檢測(cè)阿司匹林抵抗相關(guān)GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)C807T 的引物，該引物只要是基于GP I a基因的C807T位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物，并能成功擴(kuò)增出包括GP I a基因的第807位點(diǎn)的DNA片段的，均為本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容。
[0011] 優(yōu)選的，根據(jù)上述GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)C807T設(shè)計(jì)的引物為：
[0012] 正義鏈：5 '-TTCCTTAACTGTTACTTC-3'
[0013] 反義鏈：5 '-CTGTGCCATCTCCTATTT-3' ；
[0014] 或
[0015] 正義鏈：5 '-CCTTTCCGTCCGGTCACT-3'
[0016] 反義鏈：5 '-CTGTTCCACTGCTAATCT-3' ；
[0017] 或
[0018] 正義鏈：5 '-GGTCACTTGACCACTTAA-3' ；
[0019] 反義鏈：5 '-CTAATCTCTCTTTGGTTC-3'。
[0020] 基于GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)C807T的引物在制備篩選阿司匹林抵抗患者試劑盒 中的應(yīng)用，包括利用GP I a(C807T)位點(diǎn)引物對(duì)缺血性卒中患者的DNA進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè) 到攜帶有GP I a突變體807T的患者，則該患者有更易產(chǎn)生阿司匹林抵抗的趨勢(shì)，檢測(cè)方 法包括但不限于目前已有的針對(duì)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)技術(shù)。
[0021] 包括利用本發(fā)明提供的GP I a(C807T)位點(diǎn)引物，與其他阿司匹林抵抗相關(guān)的多 態(tài)性位點(diǎn)引物結(jié)合組成的試劑盒，對(duì)患者的DNA進(jìn)行檢測(cè)，來篩選更易產(chǎn)生阿司匹林抵抗的 患者。所述的其他阿司匹林抵抗相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)為：人COX-I基因多態(tài)性位點(diǎn)（A842G)， 引物為：正義鏈：5 '-AAGCCTTATTAGAGGGTA-3' ；反義鏈：5 '-TACTTTGACGCCGGTGGG-3'。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：
[0023] 1)本發(fā)明提供的GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)（C807T)與阿司匹林抵抗相關(guān)，意在為 缺血性卒中患者更好的選擇抗血小板藥物，降低卒中復(fù)發(fā)率。
[0024] 2)本發(fā)明提供的針對(duì)檢測(cè)GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)C807T的引物，意在制備篩選 阿司匹林抵抗的患者的試劑盒。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說 明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案。
[0026] 實(shí)施例1 :
[0027] 與阿司匹林抵抗相關(guān)的GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)（C807T)的發(fā)掘：
[0028] 從卒中數(shù)據(jù)庫中調(diào)取2010~2014年卒中患者數(shù)據(jù)，根據(jù)缺血性卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)，篩 選確診為缺血性卒中患者，并且進(jìn)一步選取明確服用阿司匹林作為二級(jí)預(yù)防（二級(jí)預(yù)防是 針對(duì)已經(jīng)有腦卒中癥狀或已發(fā)生卒中后的患者而言，這些人需要預(yù)防再次發(fā)生腦卒中）的 患者為研宄對(duì)象作為總樣本（共5033人）。
[0029] 1.明確總樣本中卒中復(fù)發(fā)的人數(shù)，探討總樣本中GP I a(C807T)基因的多態(tài)性 與卒中復(fù)發(fā)的關(guān)系（表2);
[0030] 2.總樣本中，回院復(fù)診患者（包括已復(fù)發(fā)的和未復(fù)發(fā)的患者，共3429人），采集患 者外周血，采用VerifyNow儀器檢測(cè)阿司匹林反應(yīng)單元（ARU)，確定ARU彡550的人數(shù)，探討 GP I a (C807T)基因的多態(tài)性與ARU彡550的關(guān)系（表1)。
[0031] 本發(fā)明實(shí)施例中，以下兩種情況任意一種發(fā)生均視為發(fā)生阿司匹林抵抗：
[0032] 1.若患者服用阿司匹林期間，仍然發(fā)生卒中，則定義為阿司匹林抵抗；
[0033] 2.采用VerifyNow儀器檢測(cè)阿司匹林反應(yīng)單元（ARU)，如果ARU彡550,則定義為 血小板高反應(yīng)性，表明這個(gè)患者存在阿司匹林抵抗。
[0034] 結(jié)果表明，服用阿司匹林進(jìn)行二級(jí)預(yù)防的缺血性卒中患者中，與野生型患者相比， GP I a(C807T)突變型組患者阿司匹林反應(yīng)單元ARU值明顯高，且ARU彡550患者人數(shù)明 顯高于野生型組（表1);同時(shí)卒中復(fù)發(fā)率也明顯高（表2)。
[0035] 本實(shí)施例中針對(duì)GP I a(C807T)基因的多態(tài)性的檢測(cè)通過以下方法實(shí)現(xiàn)：
[0036] 針對(duì)GP I a基因多態(tài)性位點(diǎn)（C807T)設(shè)計(jì)引物如下：
[0037] 正義鏈：5 '-TTCCTTAACTGTTACTTC-3'
[0038] 反義鏈：5 '-CTGTGCCATCTCCTATTT-3'
[0039] 以患者總DNA為模板，利用常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為350bp，測(cè)序，檢測(cè) 擴(kuò)增片段的第177個(gè)堿基。野生型患者的DNA序列為SEQ ID NO. 1所示，突變型患者的 DNA序列為SEQ ID NO. 2所示。采用該對(duì)引物擴(kuò)增出的序列中第177個(gè)堿基對(duì)應(yīng)GP I a 基因中的第807位點(diǎn)。
[0040] 表1 GP I a (C807T)野生型患者與突變型患者ARU值
[0041]
[0042] 表