豬細(xì)小病毒5b、用法及疫苗的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 序列表
[0002] 本申請(qǐng)案含有符合37C. F. R. 1. 821-1. 825之序列表。本申請(qǐng)案隨附之序列表特此 以全文引用方式并入。該ASCII復(fù)本系在2013年3月21日創(chuàng)建，命名為10-0153-PCT-SEQ. txt且大小為34, 495個(gè)字節(jié)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明屬于動(dòng)物健康領(lǐng)域且涉及新穎豬細(xì)小病毒菌株（包括用于接種之減毒菌 株）、制造方法及使用自該等新穎細(xì)小病毒菌株獲得之疫苗之治療方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 細(xì)小病毒感染眾多種動(dòng)物物種且一些細(xì)小病毒導(dǎo)致嚴(yán)重臨床疾病，但該等病毒 中大多數(shù)僅引起輕度或亞臨床感染。其屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae)且形成兩個(gè)亞 科：濃核病毒亞科（Densovirinae)，其成員感染昆蟲；及細(xì)小病毒亞科（Parvovirinae)， 其成員感染脊椎動(dòng)物。后一亞科目前包括5個(gè)屬：依賴病毒屬（Dependovirus)、紅病毒屬 (Erythrovirus)、紹阿留申病毒屬（Amdovirus)、博卡病毒屬（Bocavirus)及細(xì)小病毒屬 (Parvovirus)(1)〇
[0005] 細(xì)小病毒病毒體無(wú)包膜且含有約5至6千個(gè)堿基（kb)之單股線性DNA基因組。該 基因組由編碼非結(jié)構(gòu)蛋白及衣殼蛋白之兩個(gè)主要開放閱讀框（ORF)組成。最近闡述之博卡 病毒攜帶位于該兩個(gè)主要ORF之間之第三ORF(I)。
[0006] 細(xì)小病毒屬之典型豬細(xì)小病毒（PPVl)菌株廣泛分布于世界各處且造成豬之生殖 障礙，尤其在未正確地實(shí)施接種方案或疫苗功效因免疫抑制因子而下降之畜群中。在過(guò)去 十年期間，已在豬中檢測(cè)到多種新細(xì)小病毒。該等包括豬細(xì)小病毒2 (PPV2) (2)及相關(guān)病毒 (3)。在香港鑒定出一組新的豬及牛細(xì)小病毒，即胡可病毒（hokovirus) (PhoV、BHoV) (4)， 且發(fā)現(xiàn)該等病毒與人類PARV4及5在遺傳上相似。盡管其最初系以香港命名為香港病毒， 但有人提出新將其PHoV分類為PPV3 (5)。PPV4顯示與牛細(xì)小病毒2相似性最高，但編碼容 量及基因組組構(gòu)與博卡病毒之那些相似，因?yàn)镻PV4同博卡病毒一樣編碼位于ORFl與0RF2 之間之另一 0RF3。然而，PPV4編碼之推定0RF3蛋白顯著不同于博卡病毒編碼之推定0RF3 蛋白（5)。
[0007] 業(yè)內(nèi)一直需要監(jiān)測(cè)豬之新病毒之出現(xiàn)且需要針對(duì)新病毒研發(fā)疫苗、治療及檢測(cè)方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供新穎核苷酸序列、蛋白序列、免疫原性組合物、疫苗及關(guān)于制備及使用 尤其感染馴養(yǎng)豬之新細(xì)小病毒菌株之方法。該等菌株與在來(lái)自臨床上發(fā)病之馴養(yǎng)豬之組織 樣品中鑒定之新穎豬細(xì)小病毒相關(guān)；基于與已知豬細(xì)小病毒物種及菌株之序列同源性，將 該新穎病毒命名為豬細(xì)小病毒5B或PPV5B。
[0009] 本發(fā)明之組合物及方法供以檢測(cè)由該新病毒導(dǎo)致之感染、監(jiān)測(cè)野生及馴養(yǎng)動(dòng)物及 畜群中病毒序列之遺傳改變、及制備及使用新穎疫苗用以保護(hù)動(dòng)物免于感染該病毒。
[0010] 本發(fā)明之免疫原性組合物及疫苗包含由SEQ ID NO: 1之核酸序列編碼之多肽序列 或其免疫原性片段，視情況包括佐劑用以誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫原性反應(yīng)。
[0011] 本發(fā)明之例示性組合物包含對(duì)特異性針對(duì)PPV5B之抗體具有免疫反應(yīng)性之SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ N0:4之多肽序列中之任一者或其片段。本發(fā)明之較佳多肽包括SEQ ID NO:4之序列。較佳地，那些多肽或其片段對(duì)特異性針對(duì)PPV5B之抗體具有免疫反應(yīng)性。
[0012] 在另一方面中，本發(fā)明提供編碼一或多種多肽、抗體構(gòu)建體或抗體綴合物之核酸 序列。編碼多肽之基因序列包含與SEQ ID N0:1之序列至少95%、90%、85%或甚至80%同 源性及/或相同性之核酸序列，具體而言，編碼對(duì)特異性針對(duì)PPV5B之抗體具有免疫反應(yīng)性 之多肽之SEQ ID NO: 1之第2861位第至5014位核苷酸序列（衣殼蛋白）或SEQ ID NO: 1 之片段。本發(fā)明之例示性核酸序列包括編碼對(duì)特異性針對(duì)PPV5B之抗體具有免疫反應(yīng)性之 多肽之SEQ ID NO: 1之第935位至第2024位核苷酸、SEQ ID NO: 1之第2161位至第2860 位核苷酸及SEQ ID NO: 1之第2861位至第5014位核苷酸之序列中之任一者及其片段。較 佳地，該等核酸序列或基因系編碼對(duì)特異性針對(duì)PPV5B之抗體具有免疫反應(yīng)性之多肽或肽 之那些。
[0013] 此外，本文所用本發(fā)明之多肽包括但不限于包含以下多肽：
[0014] i)包含 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 之氨基酸序列之多肽；
[0015] ii)與i)之多肽至少80%同源性及/或相同性之多肽；
[0016] iii) i)及/或ii)之多肽之片段；
[0017] iv)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之序列中所包括之至少13個(gè)、較佳地15 個(gè)、更佳地17個(gè)、甚至更佳地20個(gè)鄰接氨基酸之iii)或iv)之片段；
[0018] V)由包含SEQ ID NO: 1之第935位至第2024位核苷酸、SEQ ID NO: 1之第2161 位至第2860位核苷酸或SEQ ID NO: 1之第2861位至第5014位核苷酸之序列之多核苷酸 編碼之多肽；
[0019] vi)由與vi)之多核苷酸至少80%同源性或相同性之多核苷酸編碼之多肽；
[0020] vii)由包含SEQ ID NO: 1之第2161位至第2860位核苷酸或SEQ ID NO: 1之第 2861位至第5014位核苷酸之序列中所包括之至少39個(gè)、較佳地45個(gè)、更佳地51個(gè)、甚至 更佳地60個(gè)鄰接核苷酸之多核苷酸編碼之蛋白質(zhì)片段。
[0021] 包含至少一種或多種如本文所定義PPV5B多肽之本發(fā)明免疫原性組合物可進(jìn)一 步包含生理學(xué)上可接受之媒劑，例如醫(yī)藥上或獸醫(yī)學(xué)上可接受之載劑、佐劑或其組合。
[0022] 此處所提供之PPV5B多肽中之任一者或任何包含此處所提供之該等PPV5B多肽中 之一或多者之免疫原性組合物皆可用作藥劑，較佳地用作疫苗或免疫原性組合物，最佳地 用于預(yù)防或治療對(duì)象以對(duì)抗PPV5B感染。
[0023] 特別佳之PPV5B多肽包括具有誘導(dǎo)對(duì)特異性針對(duì)PPV5B之免疫反應(yīng)之免疫原性表 位之那些。較佳PPVB多肽包括具有預(yù)計(jì)在相關(guān)PPVl中為表面抗原之氨基酸序列之那些 (Simpson等人，JMB 315, 2002)且包括但不限于SEQ ID N0:4之第289位、第375位至第 381位及第431位至443位殘基。
[0024] 熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者應(yīng)了解，本文所用組合物可納入已知可注射生理學(xué)上可接受之無(wú) 菌溶液。對(duì)于制備用于非經(jīng)腸注射或輸注之即用溶液，水性等滲溶液（例如鹽水或血漿蛋 白質(zhì)溶液）可容易地得到。另外，本發(fā)明之免疫原性及疫苗組合物可包括獸醫(yī)學(xué)上可接受 之載劑、稀釋劑、等滲劑、穩(wěn)定劑或佐劑。
[0025] 本發(fā)明方法包括但不限于在對(duì)象中激發(fā)對(duì)抗PPV5B感染之免疫反應(yīng)之方法，該方 法包含向?qū)ο笫┯冒换蚨喾N如本文所定義PPV5B多肽之免疫原性組合物之步驟。較佳 地，所激發(fā)免疫反應(yīng)對(duì)抗多于一種PPV5B血清型或菌株。本發(fā)明組合物可用于治療或另一 選擇為預(yù)防PPV5B感染。較佳地，該免疫反應(yīng)降低與感染一或多種PPV5B血清型相關(guān)或因 感染一或多種PPV5B血清型而引起之一或多個(gè)臨床體征之發(fā)生率或嚴(yán)重程度。
[0026] 在本文中，可施用本發(fā)明組合物之適宜對(duì)象及有需要的對(duì)象包括需要預(yù)防或治療 相關(guān)病毒性、微生物性、寄生性、原蟲性、細(xì)菌性或真菌性感染、疾病或病況的動(dòng)物。利用本 發(fā)明組合物或方法刺激免疫反應(yīng)之動(dòng)物包括家畜，例如豬、牛、家禽（例如雞、鴨、鵝或火 雞）、山羊及綿羊；以及馴養(yǎng)動(dòng)物，例如小鼠、兔、狗、貓及馬。較佳之動(dòng)物包括豬、鼠科動(dòng)物、 馬科動(dòng)物、兔類動(dòng)物及?？苿?dòng)物。最佳地，刺激豬之免疫反應(yīng)。
[0027] 本發(fā)明亦提供降低與PPV5B感染相關(guān)或由該感染引起之一或多個(gè)臨床體征之發(fā) 生率或嚴(yán)重程度之方法，其包含施用包含一或多種由此提供之PPV5B肽及較佳地載劑分子 之本發(fā)明之免疫原性組合物之步驟，以使得PPV5B感染之臨床體征之發(fā)生率或嚴(yán)重程度相 對(duì)于未接受由此提供之免疫原性組合物之對(duì)象降低至少10%、較佳至少20%、甚至更佳至 少30%、甚至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。該等臨床體征包括僅因 感染PPV5B導(dǎo)致之病毒血癥及免疫抑制。該等臨床體征可包括神經(jīng)學(xué)體征（情緒低落、共 濟(jì)失調(diào)、嗜睡）、腹瀉、呼吸困難、體況下降、關(guān)節(jié)腫脹（導(dǎo)致跛行及仰臥）、平均日增重減少、 死亡率及與另一生物體（例如，豬鼻霉衆(zhòng)菌（Mycoplasma hyorhinis))共感染導(dǎo)致之多發(fā) 性漿膜炎。
[0028] 根據(jù)又一方面，本發(fā)明亦關(guān)于預(yù)防PPV5B感染之方法，其中該P(yáng)PV5B感染可能由 PPV5B引起，該P(yáng)PV5B與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列具有100%序列相同性；與SEQ ID NO: 1 之核苷酸序列具有至少95%序列相同性；與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列具有至少90%序 列相同性；或與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列具有至少85%序列相同性；該方法包含施用本 發(fā)明之免疫原性組合物之步驟，該免疫原性組合物包含一或多種由此提供之PPV5B肽，即， 至少一種分別與SEQ ID N0:3及/或SEQ ID NO:4之多肽序列具有100%、至少95%、至少 90%及/或至少85%序列相同性之多肽或其包含SEQ ID N0:3及/或SEQ ID N0:4之序列 中所包括之至少12個(gè)、較佳地15個(gè)、更佳地17個(gè)、甚至更佳地20個(gè)鄰接氨基酸之片段。
[0029] 本發(fā)明亦提供制備任一由此提供之免疫原性組合物之方法，該方法包含將一或多 種由此提供之PPV5B肽與載劑分子混合，較佳地使得該一或多種PPV5B肽與載劑分子系彼 此共價(jià)偶合或綴合。該等綴合物可為多價(jià)或單價(jià)。多價(jià)組合物或疫苗包括多種PPV5B肽與 載劑分子之免疫綴合物。在又一方面中，本發(fā)明提供制造一或多種PPV5B肽之方法，該方法 包含用編碼任一由此提供之PPV5B肽之核酸分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、較佳地原核細(xì)胞（例如大 腸桿菌（E. coli))。另一選擇為，宿主細(xì)胞可為真核細(xì)胞，例如動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、原蟲細(xì) 胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。較佳地，真核細(xì)胞系哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如CH0、BHK或COS ;或真菌 細(xì)胞，例如啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae);或昆蟲細(xì)胞，例如Sf9。本發(fā)明核酸 之桿狀病毒表達(dá)亦較佳。
[0030] 本發(fā)明之另一方面提供制造一或多種PPV5B肽之方法，該等PPV5B肽誘導(dǎo)對(duì)抗至 少一種PPV5B遺傳變體且更佳地兩種或更多種PPV5B遺傳變體之免疫反應(yīng)。此包含培養(yǎng)編 碼并表達(dá)一或多種本文所揭示PPV5B肽之經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)載體。經(jīng)表達(dá)蛋白質(zhì)系保留在表達(dá)生 物體中或分泌至培養(yǎng)基中。表達(dá)系在足以產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)對(duì)PPV5B之免疫反應(yīng)之PPV5B肽 之條件下進(jìn)行。致使PPV5B肽誘導(dǎo)免疫反應(yīng)之PPV5B血清型包括但不限于具有至少99%、 98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或 90%相同性之序列。
[0031] 制備本發(fā)明組合物之方法可進(jìn)一步包含混合一或多種PPV5B肽與載劑分子之綴 合物與生理學(xué)上可接受之媒劑，例如醫(yī)藥上或獸醫(yī)學(xué)上可接受之載劑、佐劑或其組合。熟習(xí) 此項(xiàng)技術(shù)者應(yīng)認(rèn)識(shí)到，媒劑、佐劑或組合之選擇將尤其由遞送途徑、個(gè)人偏好及動(dòng)物種類來(lái) 決定。
[0032] 在另一方面中，本發(fā)明提供診斷對(duì)象之PPV5B感染之方法。該方法包含提供一或 多種PPV5B肽；使該一或多種PPV5B肽與自該對(duì)象獲得之樣品接觸；及若在該樣品中檢測(cè) 到能夠結(jié)合該一或多種PPV5B肽之抗體，則將該對(duì)象鑒定為具有PPV5B感染。
[0033] 在另一方面中，本發(fā)明提供確定先前已暴露于PPV5B感染且能夠表達(dá)對(duì)PPV5B之 免疫反應(yīng)之對(duì)象之方法。該方法包含提供一或多種PPV5B肽；使該一或多種PPV5B肽與自 該對(duì)象之獲得樣品接觸；及若在該樣品中檢測(cè)到能夠結(jié)合該一或多種PPV5B肽之抗體，則 將該對(duì)象鑒定為具有PPV5B感染。
[0034] 本發(fā)明亦提供試劑盒，其包含：包含一或多種PPV5B肽、較佳地連同載劑分子之免 疫原性組合物；用于封裝該免疫原性組合物之容器；一套印刷說(shuō)明書；及能夠向動(dòng)物施用 該免疫原性組合物之分配器。視情況，該一或多種PPV5B肽及該載劑分子可以綴合物形式 或以單獨(dú)化合物形式封裝。當(dāng)單獨(dú)供應(yīng)時(shí)，亦供應(yīng)綴合該一或多種PPV5B肽與載劑分子之 構(gòu)件以及適當(dāng)印刷說(shuō)明書。
[0035] 本發(fā)明亦提供用于接種動(dòng)物之試劑盒，其包含一套印刷說(shuō)明書；能夠向動(dòng)物施用 由此提供之包含一或多種PPV5B肽之該免疫原性組合物之分配器；且其中PPV5B肽中之至 少一者有效地免疫該動(dòng)物以對(duì)抗至少一種與PPV5B感染相關(guān)之疾病。較佳地，該一或多種 PPV5B肽系選自由此提供之那些。本發(fā)明試劑盒可進(jìn)一步包含獸醫(yī)學(xué)上可接受之載劑、佐劑 或其組合。
[0036] 本發(fā)明試劑盒中之分配器能夠?qū)⑵鋬?nèi)含物以微滴形式分配；且該試劑盒中所包括 之包含此處所提供之PPV5B肽之該免疫原性組合物在經(jīng)鼻內(nèi)、經(jīng)口、真皮內(nèi)或肌內(nèi)施用動(dòng) 物時(shí)能夠降低PPV5B感染之至少一個(gè)臨床體征之嚴(yán)重程度。較佳地，使臨床體征之嚴(yán)重程 度與未經(jīng)治療之受感染動(dòng)物相比降低至少10%、較佳地至少20%、甚至更佳至少30%、甚 至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。
[0037] 本發(fā)明亦揭示治療或預(yù)防由PPV5B引起之感染之方法。該方法包含向?qū)ο笫┯糜?效量之本發(fā)明之免疫原性組合物，其中該治療或預(yù)防系選自由下列組成之群：減少PPV5B 感染之體征、降低PPV5B感染臨床體征之嚴(yán)重程度或發(fā)生率、降低由PPV5B感染引起之對(duì)象 死亡率及其組合。
[0038] 本發(fā)明組合物進(jìn)一步包含獸醫(yī)學(xué)上可接受之載劑、佐劑或其組合。該等組合物 可用作疫苗且包含一或多種其它減毒疫苗、滅活疫苗或其組合。該等疫苗引發(fā)對(duì)抗至少 一種與選自由下列組成之群之病毒相