一種煙草疫霉的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種煙草疫霉的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草黑腔?。╰obacco black shank)是由煙草疫霉（Phytophtora nicotianae) 引起的煙草生產(chǎn)中僅次于病毒病的第二大類病害。該病危害嚴重，廣泛分布于溫帶、亞熱帶 和熱帶地區(qū)。目前，防治該病最好的方法是篩選抗煙草黑脛病的煙草植株，而抗病植株的篩 選需要經(jīng)過抗性測定。
[0003] 目前，在煙草黑脛病的抗性測定中常用的煙草疫霉接種體有菌絲塊、菌絲液、游動 孢子液、菌谷等。大田接種一般采用菌谷。所謂的菌谷是將平板培養(yǎng)得到的菌絲塊直接接 種到水稻培養(yǎng)基表面進行固體培養(yǎng)而獲得的接種體。
[0004] 在菌谷培養(yǎng)的過程中，由于平板培養(yǎng)與固體培養(yǎng)的基質(zhì)成分差異大，將煙草疫霉 菌絲從平板培養(yǎng)轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)時，菌絲通常需要2~3天的適應(yīng)期，在適應(yīng)期內(nèi)菌絲不能 很快占領(lǐng)基質(zhì)而為其他雜菌提供了生長的機會，容易導致雜菌污染，培養(yǎng)失敗。因此，如何 快速有效地培養(yǎng)煙草疫霉是煙草黑脛病抗性測定中值得探索的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明實施例公開了一種煙草疫霉的培養(yǎng)方法。技術(shù)方案如 下：
[0006] 一種煙草疫霉的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0007] 1)、平板培養(yǎng)
[0008] 將煙草疫霉菌株接種在麥粒濾液培養(yǎng)基上，26~28°C培養(yǎng)7~10天，獲得平板培 養(yǎng)的菌絲塊；
[0009] 2)、固體培養(yǎng)
[0010] 將平板培養(yǎng)的菌絲塊接種于麥粒培養(yǎng)基中，26~28°C培養(yǎng)7~10天，可得煙草疫 霉的接種體，即菌谷；
[0011] 其中，所述麥粒濾液培養(yǎng)基的制備方法為：將帶殼麥粒用水浸泡8~12小時后紗 網(wǎng)過濾，得到濾液和過濾后的帶殼麥粒，向濾液中加入瓊脂，滅菌處理，即可得到所述麥粒 濾液培養(yǎng)基；所述帶殼麥粒與水的體積比為I: (1~1. 6);所述瓊脂在濾液中的加入量為 (17 ~20)g/L;
[0012] 所述麥粒培養(yǎng)基的制備方法：將過濾后的帶殼麥粒與秸桿粒混勻，滅菌處理，制得 所述麥粒培養(yǎng)基；所述過濾后的帶殼麥粒與秸桿粒的體積比為（70~90) : (10~30)。
[0013] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述平板培養(yǎng)的菌絲塊在所述麥粒培養(yǎng)基上的 接種量為將5~IOcm 2表面積的菌絲塊接種于100~200mL的麥粒培養(yǎng)基中。
[0014] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，在平板培養(yǎng)之前，先進行活化培養(yǎng)，即將菌株接 種在麥粒濾液培養(yǎng)基上，26~28°C培養(yǎng)2~3天，之后再在相同的培養(yǎng)條件下，繼代培養(yǎng) 1~2次。
[0015] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述帶殼麥粒為燕麥、黑麥、小麥中的一種或多 種。
[0016] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述秸桿粒為新鮮的的豌豆秸桿、蠶豆秸桿、玉 米秸桿、甘蔗渣中的一種粉碎而成。
[0017] 在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施方式中，所述秸桿粒的粒徑為3~5mm。
[0018] 在本發(fā)明的一種更優(yōu)選實施方式中，所述秸桿粒的含水量為50 %~60%。
[0019] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述麥粒與水的體積比為I: (1. 2~1. 4)。
[0020] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，所述過濾后的帶殼麥粒與秸桿粒的體積比為 70:30。
[0021] 本發(fā)明采用麥粒濾液和過濾后的帶殼麥粒分別作為煙草疫霉菌株的培養(yǎng)基質(zhì)，由 于麥粒濾液和過濾后的帶殼麥粒的成分相似，使得菌絲塊在從麥粒濾液培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到麥粒 培養(yǎng)基培養(yǎng)時，迅速適應(yīng)麥粒培養(yǎng)基的生長條件，不間斷地生長，無適應(yīng)期，快速均勻地占 領(lǐng)基質(zhì)，不給其他雜菌提供生長機會，減少污染，并且麥粒培養(yǎng)基由帶殼麥粒和秸桿粒組 成，間隙度和疏松度適合煙草疫霉的菌絲快速生長，比常規(guī)菌谷培養(yǎng)（GB/T 23224-2008煙 草品種抗病性鑒定）縮短5~13天。而且本發(fā)明的煙草疫霉的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基配方簡單， 制作方便，成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0022] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，平板培養(yǎng)，通常是將菌株接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，因此本領(lǐng) 域技術(shù)人員將其稱為平板培養(yǎng)；固體培養(yǎng)，選用用水浸泡并過濾后的帶殼麥粒和秸桿作為 麥粒培養(yǎng)基，最后得到菌絲和麥粒培養(yǎng)基的混合物，本領(lǐng)域稱其為菌谷。在煙草抗性測定 中，用菌谷侵染煙草植株。本方法制備的菌谷可用于煙草黑脛病的人工接種物，或者用于制 備帶煙草黑脛病菌病土的添加物。
[0023] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，菌絲塊在麥粒培養(yǎng)基中的接種量為5~IOcm2表面積的 菌絲塊接種于100~200mL的麥粒培養(yǎng)基中。此條件保證了合理的接種密度，使得煙草疫 霉菌株快速占領(lǐng)麥粒培養(yǎng)基，不給雜菌提供生存空間，又避免在固體培養(yǎng)期間，煙草疫霉種 內(nèi)競爭。
[0024] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，在平板培養(yǎng)之前，可以先進行活化培養(yǎng)，即將菌株接種在 麥粒濾液培養(yǎng)基上，26~28°C培養(yǎng)2~3天，之后再在相同的培養(yǎng)條件下，繼代培養(yǎng)1~2 次。目的是為了使菌株充分活化，這樣在固體培養(yǎng)階段能夠更快速的生長，更好的減少了被 雜菌污染的機會。
[0025] 本發(fā)明帶殼麥粒優(yōu)選為燕麥、黑麥、小麥中的一種或多種，其好處在于提供好氧環(huán) 境的同時，帶殼麥粒的表面也可提供菌絲培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)，菌絲可以在帶殼麥粒四周均 勾生長。
[0026] 本發(fā)明的秸桿粒優(yōu)選為新鮮的的豌豆秸桿、蠶豆秸桿、玉米秸桿、甘蔗渣中的一種 粉碎而成，好處在于增加培養(yǎng)基的通透性，同時使培養(yǎng)物更容易分散。秸桿粒的粒徑為3~ 5_，稻桿粒的含水量為50%~60%，為菌株生長提供良好的透氣性和濕度。
[0027] 在本發(fā)明的技術(shù)方案中，麥粒濾液培養(yǎng)基的制備方法可以包括：將帶殼麥粒用水 浸泡8~12小時后紗網(wǎng)過濾，得到濾液和過濾后的帶殼麥粒，向濾液中加入瓊脂，滅菌處 理，即可得到所述麥粒濾液培養(yǎng)基；
[0028] 其中，麥粒與水的體積比為I: (1~1. 6)，優(yōu)選I: (1. 2~1. 4)，此比例下獲得的濾 液即可為菌株生長提供充足的營養(yǎng)。
[0029] 麥粒培養(yǎng)基的制備方法可以包括：將過濾后的帶殼麥粒與秸桿粒混勻，滅菌處理， 制得所述麥粒培養(yǎng)基；其中，過濾后帶殼麥粒與秸桿粒的體積比為（70~90) : (10~30)， 優(yōu)選70:30,好處在于增加透氣性，能使菌絲迅速長滿培養(yǎng)基質(zhì)，培養(yǎng)后麥粒與秸桿粒之間 的菌絲疏密不同，更易于分散。
[0030] 需要說明的是，本發(fā)明提供的一種煙草疫霉的培養(yǎng)方法需要在無菌的條件下實 施。本發(fā)明所述