一種人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清的生產(chǎn)方法及凍干方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種干細(xì)胞衍生物生物制品及其制備方法，尤其是一種低成本的大量生產(chǎn)人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清及其凍干的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)在培養(yǎng)中分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、人表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)和肝細(xì)胞生長因子(HGF)在內(nèi)的多種促進(jìn)皮膚細(xì)胞再生的生長因子。MSC還分泌大量的可以增加皮膚健康和外觀的細(xì)胞外間質(zhì)。將MSC的培養(yǎng)液收集，凍干之后，易于保存，可以和護(hù)膚品同時使用以達(dá)到養(yǎng)顏護(hù)膚的作用。
[0003]人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的移植已經(jīng)在多個領(lǐng)域得到臨床應(yīng)用，包括治療退行性神經(jīng)病變，新生兒腦缺血和成人腦中風(fēng)，以及癌癥治療中的應(yīng)用，也被應(yīng)用到矯正皮膚缺陷，但是其培養(yǎng)上清液在養(yǎng)顏護(hù)膚中的使用才剛剛開始。
[0004]但是，目前人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清的生產(chǎn)方法大都非常麻煩，而且生產(chǎn)量較小，上清液中的各種生長因子的量也較小，質(zhì)量差，可見，現(xiàn)有的方法生產(chǎn)制得的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清已經(jīng)不能完全滿足現(xiàn)有的使用。
[0005]成都清科生物科技有限公司申請(專利)號:CN201410238533.3 ;申請日:2014.05.30 ;申請公布號:CN104013644A ;公開公告日:2014.09.03。該申請用于修復(fù)皮膚衰老的間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基制劑，其制備方法包括常規(guī)條件下培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞至其生長密度為60%?80 %，然后進(jìn)行換液處理，使用無酚紅的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入黃芪甲苷，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)完畢后去除分子量3000以下的細(xì)胞因子，進(jìn)行濃縮，并對培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測，并在濃縮后的培養(yǎng)基溶液中加入0.01毫克/毫升?0.6毫克/毫升的還原型谷胱甘肽和0.01%?0.4%的透明質(zhì)酸。
[0006]上述專利公開文獻(xiàn)培養(yǎng)上清液的收集時間比較短，僅24h，能夠收集到的生長因子等細(xì)胞分泌物的量比較小。故而需要進(jìn)一步使用超濾方法進(jìn)行濃縮，加大了工作量和生產(chǎn)成本。
[0007]廣州愛菲科生物科技有限公司申請?zhí)?201310133711.1 ;申請日:2013-04_17。該發(fā)明涉及一種人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍干粉及其制備方法，所述制備方法包括以下步驟:用含有自體血清的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代人間充質(zhì)干細(xì)胞；收集低傳代倍數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液；將所收集的上清液制備成凍干粉。為人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
[0008]該方法使用自體血清培養(yǎng)人間充質(zhì)干細(xì)胞。在臨床應(yīng)用中使用自身血清是出自與免疫排斥反應(yīng)有關(guān)的考慮。但是自身血清的來源極為受限制，而且當(dāng)人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備是為了外用時，并沒有必要使用自身血清。
[0009]通過技術(shù)特征對比，本發(fā)明專利申請與上述專利公開文獻(xiàn)存在本質(zhì)的不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種大幅度地降低了成本、減少了所需空間、縮短總的培養(yǎng)時間、低成本的大量生產(chǎn)人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清及其凍干的方法，該生產(chǎn)方法在細(xì)胞完全培養(yǎng)基中保留低濃度胎牛血清(3% FBS)，這樣與無血清相比，細(xì)胞的狀況更加健康，可以保證上清液的質(zhì)量，該培養(yǎng)液上清可以應(yīng)用在養(yǎng)顏護(hù)膚中，該培養(yǎng)液上清凍干制劑再溶后可以和護(hù)膚品同時使用可以達(dá)到養(yǎng)顏護(hù)膚的作用。
[0011]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
[0012]一種人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清的生產(chǎn)方法，步驟如下:
[0013]⑴臍帶取材:
[0014]①高溫消毒手術(shù)器械和大玻璃皿，同時紫外線消毒超凈工作臺；
[0015]②嚴(yán)格篩選臍帶供者，血液化驗排除常見的傳染?。?br>[0016]③在低溫冰盒中運(yùn)送臍帶，置臍帶于大玻璃皿中，剪成小段，再縱向切開，使用含青鏈霉素的磷酸鹽緩沖鹽水清洗臍帶，洗凈血液；
[0017]④將洗凈血液的臍帶組織剪成小碎塊，即得臍帶碎塊；
[0018]⑤向兩支50 _升咼心管中分別加入5 _升臍帶碎塊和20暈升2暈克/ _升膠原酶IV，在37°C搖床上消化1.5-2小時；
[0019]⑥每管加入完全培養(yǎng)基到45毫升刻度，在2200轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
[0020]其中，完全培養(yǎng)基的組成是DMEM/F12(質(zhì)量比為1:1)加入DMEM和F12總質(zhì)量10%的胎牛血清，所述DMEM/F12培養(yǎng)基不含酚紅；
[0021]⑦棄除上懸液，加入完全培養(yǎng)基到45毫升，再同樣離心一次，之后棄除上懸液；
[0022]⑵人間充質(zhì)干細(xì)胞的接種和在培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增:
[0023]①將每個離心管中分散的細(xì)胞連及未完全消化的臍帶組織懸浮于40毫升完全培養(yǎng)基中，并加入到四支T75培養(yǎng)瓶中，每培養(yǎng)瓶加10毫升，之后再向每個T75培養(yǎng)瓶中加入20 _升完全培養(yǎng)基；
[0024]②第二天，將組織和液體全部移到另兩支T75培養(yǎng)瓶中，原培養(yǎng)瓶中加入30毫升新鮮完全培養(yǎng)基；
[0025]③第四天，全部T75培養(yǎng)瓶置換30毫升完全培養(yǎng)基；
[0026]④此后每3天更換一次完全培養(yǎng)液，直到細(xì)胞長滿100%面積便進(jìn)行胰酶消化傳代；
[0027]⑤胰酶消化傳代:
[0028]使用磷酸鹽緩沖鹽水清洗T75中培養(yǎng)的細(xì)胞2次，質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶-EDTA消化，每T75培養(yǎng)瓶使用3-5毫升，37°C消化10分鐘；待細(xì)胞懸浮后每個T75培養(yǎng)瓶中加入2.5毫升5% FBS培養(yǎng)基，在1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
[0029]再懸浮于總量40毫升質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5% FBS培養(yǎng)基，然后進(jìn)行傳代；
[0030]⑥此后每3天換一次5% FBS培養(yǎng)基，培養(yǎng)細(xì)胞直到長滿90%面積，從此開始收集培養(yǎng)上清液，凍存在_20°C，得人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清，同時獲得培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞；
[0031]⑶人間充質(zhì)干細(xì)胞在Nunc細(xì)胞工廠中培養(yǎng)和收集培養(yǎng)液上清:
[0032]①胰酶消化傳代到Nunc細(xì)胞工廠:PBS清洗步驟⑵⑥中獲得的培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞2次，0.25%胰酶-EDTA消化，每T75用3_5毫升，37°C、10分鐘，待細(xì)胞懸浮后每個T75加入
2.5毫升5% FBS培養(yǎng)基，在1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，再懸浮于5% FBS培養(yǎng)基中，傳代到10層Nunc細(xì)胞工廠和一個新T75中，或者使用兩個四層細(xì)胞工廠代替10層Nunc細(xì)胞工廠；
[0033]②直到細(xì)胞長滿60%面積，便將FBS的質(zhì)量濃度降到3%，F(xiàn)BS濃度降到3%之后每3天收集一次培養(yǎng)液上清，共收集四次便結(jié)束培養(yǎng)，即得人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清，-20 °C凍存?zhèn)溆谩?br>[0034]而且，所述步驟⑴②中傳染病包括艾滋病、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎；或者，所述步驟⑴②中剪成小段為剪成3段、每段5厘米長的小段。
[0035]而且，所述步驟⑴③中的磷酸鹽緩沖鹽水中含有質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為I %的青鏈霉素。
[0036]而且，所述步驟⑴④中小碎塊為2-3毫米的小碎塊。
[0037]而且，所述步驟⑵⑤中傳代的具體步驟如下:
[0038]按1:4-5比例傳代到16-30個T75培養(yǎng)瓶，每一個T75先加20毫升5% FBS培養(yǎng)基，再加2毫升細(xì)胞懸液；
[0039]或者，按1:4-5比例傳代到8個T175培養(yǎng)瓶，每一個T175培養(yǎng)瓶先加40毫升5% FBS培養(yǎng)基，再加5毫升細(xì)胞懸液。
[0040]而且，所述步驟⑶①中10層細(xì)胞工廠的完全培養(yǎng)基的總量為1700毫升培養(yǎng)基，T75培養(yǎng)瓶為20毫升，所述四層細(xì)胞工每個為650毫升培養(yǎng)基。
[0041]如上所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清的生產(chǎn)方法制備得到的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清的凍干方法，其特征在于:步驟如下:
[0042]⑴取人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清并分裝為3毫升/管；
[0043]⑵打開冷凝水泵，打開LGJ-8YXD冷凍干燥機(jī)/凍干機(jī)開始降溫；
[0044]⑶當(dāng)擱板組的溫度達(dá)到-35°C后，將培養(yǎng)液上清標(biāo)本放進(jìn)干燥箱；
[0045]⑷當(dāng)冷凝器內(nèi)的蒸發(fā)器溫度達(dá)到_50°C以下時，打開空氣壓縮機(jī)；
[0046](5)當(dāng)干燥箱內(nèi)壓力達(dá)到1Pa以下時，開始擱板加熱至20°C ;
[0047](6)當(dāng)溫度已達(dá)到制品最高許可溫度37°C并維持4個小時，直到凍干完畢，關(guān)閉所有的開關(guān)，即得凍干產(chǎn)品。
[0048]如上所述的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清的生產(chǎn)方法制備得到的人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清在養(yǎng)顏護(hù)膚中的應(yīng)用。
[0049]而且，所述應(yīng)用的使用方法如下:
[0050]使用時，用3毫升營養(yǎng)液1:1溶解人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液上清，營養(yǎng)液成分為煙酰胺、白鮮皮提取物、洋甘菊提取物、金縷梅提取物、復(fù)合維生素C和水復(fù)配而成，其中煙酰胺的質(zhì)量濃度在1% -1.5%，白鮮皮提取物的質(zhì)量濃度在0.5% -1 %，洋甘菊提取物的質(zhì)量濃度在0.5% -1 %，金縷梅提取物的質(zhì)量濃度在1% _3%