一種抗xa21蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抗XA21蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 有關(guān)水稻抗白葉枯病基因 Xa21的工作，最早可以追溯到1977年，當(dāng)時(shí)印度育種 學(xué)家S. Devadath等人對非洲馬里的長藥野生稻（Oryza Iongistaminata)進(jìn)行接種測驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)該野生稻抗所有測試的白葉枯病菌（Xoo)小種。隨后，國際水稻研宄所Khush等人將 該野生稻與感病的秈稻栽培品種IR24雜交，經(jīng)過12年轉(zhuǎn)育，于1990年獲得了以IR24為 遺傳背景的秈稻近等基因系，命名為IRBB21，Xoo接種鑒定表明，IRBB21對印度和菲律賓 所有的Xoo生理小種都有抗性。遺傳分析表明，抗性是由單一遺傳位點(diǎn)決定的，Khush將 這一來源于長藥野生稻的抗性基因命名為Xa21 (Khush G S, Bacalangco E, Ogawa T. A new gene for resistance to bacterial blight from 0. longistaminate. Rice Genet News Iettj 1990,7:121-122.) 〇
[0003] 由于Xa21具有廣譜抗病的特點(diǎn)，所以吸引了分子遺傳學(xué)家的目光。作為育種學(xué) 家的Khush將這份重要的水稻材料提供給了美國康奈爾大學(xué)的Tanksley教授。當(dāng)時(shí)在 Tanksley實(shí)驗(yàn)室的博士后Pamela Ronald等開始了 Xa21的定位工作。1995年，宋文源等 在美國加州大學(xué)戴維斯分校Pamela Ronald實(shí)驗(yàn)室并與中科院遺傳所等單位合作，克隆 了 Xa21基因，序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼類受體激酶，其預(yù)測的胞外結(jié)構(gòu)域?yàn)楦缓涟彼?的拉鏈結(jié)構(gòu)（Lesine-rich repeat, LRR)，其胞內(nèi)區(qū)為絲/蘇氨酸蛋白激酶（Song WY, Wang GL, Chen LL, Kim HS, Pi LY, Holsten T, Gardner J, Wang B, Zhai WX, Zhu LH, Fauquet C, Ronald P. A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science. 1995 270(5243) :1804-6.)。由于Xa21 對白葉枯病的廣譜 抗性及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，該基因在水稻育種中有重要的應(yīng)用價(jià)值，其機(jī)理研宄也具有重要的理論 意義。通過傳統(tǒng)的回交轉(zhuǎn)育策略，Xa21已經(jīng)被導(dǎo)入多個(gè)常規(guī)水稻品種中（翟文學(xué)，李曉兵， 田文忠，周永力，潘學(xué)彪，曹守云，趙顯峰，趙彬，章琦，朱立煌.由農(nóng)桿菌介導(dǎo)將白葉枯 病抗性基因 Xa21轉(zhuǎn)入我國的5個(gè)水稻品種.中國科學(xué)（C輯），2000, 43 (4) : 361-368.吳家 道，楊劍波，許傳萬，李莉，向太和，倪大虎，汪秀峰，賈士榮，唐益雄，張世平，F(xiàn)auquet C M.水稻抗白葉枯病基因 Xa21轉(zhuǎn)基因水稻及其雜交稻研宄.作物學(xué)報(bào)，2001，27(1) :29-34. 趙顯峰，翟文學(xué)，李平，王春連，潘學(xué)彪，錢前，李世貴，朱立煌.不同Xa21轉(zhuǎn)基因雜 交稻組合的大田試驗(yàn)與分析.作物學(xué)報(bào)，2002, 28(4) :521-527.)，所以，檢測鑒定水稻材料 中的Xa21具有重要的應(yīng)用價(jià)值。由于Xa21的序列已知，用PCR擴(kuò)增的方法可以方便地檢 測Xa21的存在與否，但這種基于DNA的擴(kuò)增并不能了解XA21蛋白質(zhì)的表達(dá)與否及表達(dá)的 時(shí)空特性，所以制備抗XA21蛋白質(zhì)的抗體，建立基于免疫學(xué)的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和 應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種抗XA21蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所提供的抗XA21蛋白的單克隆抗體具體由雜交瘤細(xì)胞系60632-18分泌產(chǎn) 生。雜交瘤細(xì)胞系60632-18,在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的登記入 冊編號(hào)為 CGMCC No. 10416。
[0006] 上述分泌抗XA21蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系60632-18也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0007] 將所述單克隆抗體用標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記后形成的標(biāo)記抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0008] 其中，所述標(biāo)記物可為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、生物素、異硫氰酸熒光素、熒 光染料Cy3、熒光染料Cy5、磁珠或瓊脂糖。
[0009] 所述雜交瘤細(xì)胞系60632-18CGMCC No. 10416或所述單克隆抗體或所述標(biāo)記抗體 在如下（al)_(a4)任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0010] (al)檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有水稻XA21蛋白；
[0011] (a2)從含有水稻XA21蛋白的樣品中富集或分離水稻XA21蛋白；
[0012] (a3)通過與水稻XA21蛋白結(jié)合形成復(fù)合物用于對所述XA21蛋白的結(jié)構(gòu)和/或功 能進(jìn)行分析；
[0013] (a4)通過與水稻XA21蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。
[0014] 在所述（al)中，所述檢測的方法包括但不限于利用所述單克隆抗體直接和抗原 結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA)、免疫印跡（Western Blot)、流式細(xì)胞術(shù)（FACS)、免疫組 織化學(xué)（IHC)檢測或者免疫PCR檢測方法。在所述檢測中，所述單克隆抗體可單獨(dú)或與通 過化學(xué)鍵偶聯(lián)，靜電吸附或者親疏水性吸附，而連接綴合物包括辣根過氧化物酶（HRP)，堿 性磷酸酶（AP)，生物素（Biotin)，異硫氰酸熒光素（FITC)，Cy3、Cy5、磁珠和瓊脂糖等綴合 物連接。
[0015] 在所述（a2)中，所述分離的方法包括但不限于利用瓊脂糖免疫、免疫磁珠吸附或 流式細(xì)胞術(shù)完成生物分離方法或陽性細(xì)胞分選。
[0016] 在所述（a3)中，是通過將所述單克隆抗體或?qū)⑺隹贵w的重鏈與輕鏈可變區(qū)序 列經(jīng)重組表達(dá)后制備的工程抗體與所述水稻XA21蛋白形成穩(wěn)定復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而 實(shí)現(xiàn)對水稻XA21蛋白的激酶區(qū)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研宄。
[0017] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測或輔助檢測水稻XA21蛋白的試劑盒。
[0018] 本發(fā)明所提供的檢測或輔助檢測水稻XA21蛋白的試劑盒中含有獨(dú)立包裝的所述 單克隆抗體或所述標(biāo)記抗體。
[0019] 所述試劑盒中還可含有獨(dú)立包裝的水稻XA21蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
[0020] 所述水稻XA21蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示。
[0021] 本發(fā)明還保護(hù)一種更大范圍的抗水稻XA21蛋白的抗體。
[0022] 該抗水稻XA21蛋白的抗體，由重鏈和輕鏈組成，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如 序列表中序列3所示；所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
[0023] 進(jìn)一步，所述抗體的重鏈恒定區(qū)的亞型為IgGla;所抗體的輕鏈恒定區(qū)的亞型為 κ輕鏈。
[0024] 所述抗體由雜交瘤細(xì)胞系60632-18CGMCC No. 10416分泌產(chǎn)生。
[0025] 編碼所述抗體的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 在所述抗體的編碼基因中，所述重鏈可變區(qū)的編碼基因具體如序列表中序列5所 示；所述輕鏈可變區(qū)的編碼基因如序列表中序列6所示。
[0027] 含有所述基因的重組載體、重組菌、重組細(xì)胞系、重組病毒或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0028] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0029] (1)本發(fā)明獲得的Xa21單克隆抗體，能識(shí)別重組XA21蛋白，具有檢測多種轉(zhuǎn)基因 植物的XA21蛋白的特性，具有廣闊的用途。
[0030] (2)本發(fā)明獲得的Xa21單克隆抗體為一種IgGla類抗體，與XA21蛋白的結(jié)合有極 強(qiáng)特異性和敏感性，ELISA方法的最低檢測限為4ng，采用免疫印跡法檢測時(shí)其檢測靈敏度 為 30ng)。
[0031] (3)可對常規(guī)及轉(zhuǎn)基因水稻中的XA21蛋白含量進(jìn)行定量分析。
[0032] (4)本發(fā)明獲得的Xa21單克隆抗體可獨(dú)立或與生物素、辣根過氧化物酶、堿性磷 酸酶等偶聯(lián)，用于WB、雙抗體夾心ELISA、間接ELISA、免疫組織化學(xué)、免疫PCR等方法對轉(zhuǎn)基 因生物進(jìn)行檢測和篩查，特異性和靈敏度高，具有很高的使用價(jià)值。
[0033] (5)本發(fā)明的Xa21單克隆抗體可以通過與瓊脂糖、磁珠結(jié)合，進(jìn)行生物樣本的親 和富集和分離。
[0034] (6)通過將本發(fā)明的Xa21單克隆抗體與FITC、Cy3、Cy5等熒光分子偶聯(lián)，用于轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析與分選，進(jìn)而完成qPCR、ELISpot或單細(xì)胞分析。
[0035] 保藏說明
[0036] 參據(jù)的生物材料（株）：60632-18
[0037] 科學(xué)描述：雜交瘤細(xì)胞系
[0038] 保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
[0039] 保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC
[0040] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)
[0041] 保藏日期：2015年3月31日
[0042] 保藏中心登記入冊編號(hào)：CGMCC No. 10416
【附圖說明】
[0043] 圖1為XA21激酶區(qū)蛋白質(zhì)（XA21K)在大腸桿菌中的表達(dá)。M :分子量標(biāo)記；Oh :是 誘導(dǎo)前的全菌超聲蛋白質(zhì)樣品；S :誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)菌超聲破碎離心的上清樣品。P :誘導(dǎo)表達(dá)細(xì) 菌超聲破碎離心的沉淀樣品。
[0044] 圖2為本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞系60632-18CGMCC No. 10416分泌的單克隆抗體檢測重 組的XA21K蛋白質(zhì)。M :分子量標(biāo)記，上樣量：泳道1-4上樣量分別為150、30、6和I. 2ng。
[0045] 圖3為用純化后的本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞系60632-18CGMCC No. 10416分泌的單克隆 抗體檢測水稻葉片樣本。M :分子量標(biāo)記；4021和CX6221b為帶有XA21的水稻材料，TP309 和MH86為不帶有XA21的水稻材料；XA21 :全長的XA21蛋白質(zhì)；HSP :用抗HSP抗體檢測作 為上樣量的內(nèi)參。
[0046] 圖4為雙抗體夾心ELISA方法檢測XA21蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0048] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0049] pGTK載體：該載體由中國科學(xué)院遺