具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復(fù)性的重組溶瘤腺病毒Ad5-P16及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及溶瘤腺病毒領(lǐng)域，具體地指一種具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復(fù) 性的重組溶瘤腺病毒Ad5-P16及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 溶瘤腺病毒能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞并具有腫瘤細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制能力。其能通過(guò)大 量復(fù)制直接溶瘤，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬、壞死，以及觸發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫等多種機(jī) 制發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，近年來(lái)得到了越來(lái)越廣泛地關(guān)注。2005年，我國(guó)SFDA批準(zhǔn)了世界上第 一個(gè)溶瘤腺病毒HlOl用于鼻咽癌患者的治療，成為全球首個(gè)獲批上市的重組溶瘤腺病毒 產(chǎn)品。目前溶瘤腺病毒或攜帶抗癌基因的溶瘤腺病毒產(chǎn)品更多的正在進(jìn)行臨床前和臨床試 驗(yàn)，其中包括 0NYX-015、SG500、ZD55-TRAIL 和 ZD55-IL-24 等。
[0003] 目前，重組溶瘤腺病毒主要有這樣幾種方式：
[0004] 1、剔除腺病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制所必須而在腫瘤細(xì)胞中不需要的部分。如去除 ElA或ElB的腺病毒只能在Rb或p53信號(hào)通路異常的腫瘤細(xì)胞內(nèi)才能增殖，目前已構(gòu)建對(duì) 應(yīng)的載體delta24和ZD55,并攜帶抗癌基因取得較好研宄效果。
[0005] 2、利用腫瘤特異性啟動(dòng)子控制病毒復(fù)制必須的基因。如利用hTERT啟動(dòng)子替換 ElA使得外源基因的表達(dá)具有腫瘤細(xì)胞特異性。
[0006] 3、修飾腺病毒衣殼蛋白，使其表達(dá)特異識(shí)別腫瘤表面受體的配體蛋白，增強(qiáng)腫瘤 細(xì)胞對(duì)其特異性識(shí)別能力，并增強(qiáng)感染效率。
[0007] 盡管目前溶瘤腺病毒在體外殺傷腫瘤細(xì)胞及體內(nèi)動(dòng)物腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)中均取得了 較好的抗腫瘤效應(yīng)，但多數(shù)尚在臨床試驗(yàn)中，并未進(jìn)入臨床。宄其原因，主要在于以下兩 占 .
[0008] 1.溶瘤腺病毒存在較高的免疫原性，容易被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別而清除達(dá)不到抗癌 效果。研宄表明，去除病毒基因組E3區(qū)可以有效降低腺病毒的免疫原性，保護(hù)腺病毒感染 的腫瘤細(xì)胞在病毒大量復(fù)制前不提前被T細(xì)胞識(shí)別清除，從而提高了病毒的感染效率。
[0009] 2.腫瘤細(xì)胞耐藥耐病毒性，由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，原始組織功能喪失，細(xì)胞內(nèi)易 發(fā)生變異，導(dǎo)致單一腫瘤殺傷作用無(wú)法徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)。研宄表明， 經(jīng)病毒殺傷后，部分殘存的腫瘤細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)PLSR1/STING/IR3等信號(hào)通路抑制病毒復(fù) 制及殺傷作用。解決辦法之一是，利用病毒本身即是一種有效地基因載體，攜帶外源抑癌基 因或癌基因干擾序列，修復(fù)腫瘤細(xì)胞基因變異，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及誘發(fā)死亡，有效協(xié)同病 毒自身殺傷作用，在耐病毒性突變出現(xiàn)前，徹底殺滅癌細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是提供一種具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復(fù) 性的重組溶瘤腺病毒Ad5-P16及其應(yīng)用。
[0011] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的一種具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復(fù)性 的重組溶瘤腺病毒Ad5-P16,所述重組溶瘤腺病毒Ad5-P16全基因組是由P16⑶S基因替換 原溶瘤腺病毒Ad5全基因組上的固有基因 E3gp-19K得到。
[0012] 進(jìn)一步地，所述P16⑶S基因序列如SEQ ID No. 1所示。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種含有高效表達(dá)抗癌基因 P16的重組溶瘤腺病毒Ad5_P16的構(gòu) 建方法，包括以下步驟：
[0014] 1)以pCMV pl6INK4A為模板，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的引物上下游引物PF 和PR，
[0015] PF :ctgatatgcatggagccggcggcggggag，
[0016] PR ：gccgcggccgctcaatcggggatgtctgagg ；
[0017] 2)經(jīng) PCR 得到 P16CDS 序列
[0018] PCR條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0019] 3)將PCR產(chǎn)物連接入TA載體，挑選單克隆，并鑒定出陽(yáng)性克隆子；
[0020] 4)然后在E3gp-19K上游啟動(dòng)子U6前方設(shè)計(jì)上游引物Pl和E3gp-19K編碼區(qū)終止 密碼子后方設(shè)計(jì)下游引物P6,分別為：
[0021] Pl:cggaagcttacgtaccggtccaatccgtc，
[0022] P6 ：ggcgaattcaggtcgtaaacgtccacacgt ；
[0023] 并以Ad5腺病毒全基因組為模板，進(jìn)行PCR ;
[0024] PCR條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0025] 得到含有E3gp-19K序列的PCR產(chǎn)物；將PCR產(chǎn)物和pUC18載體進(jìn)行雙酶切， 連接后并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選單克隆后進(jìn)行酶切與測(cè)序鑒定，得到陽(yáng)性克隆，即構(gòu)建為 pUC18-E3gp-19K ；
[0026] 5)在E3gp_19K編碼區(qū)初始密碼子前方設(shè)計(jì)下游以snal酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基為 5 '末端的正向引物 P2 :ctgatatgcatatggacacaaggatgacga，
[0027] 及其反相互補(bǔ)引物 P3 :tcgtcatccttgtgtccatatgcatatcag ;
[0028] 在E3gp-19K編碼區(qū)終止密碼子后方設(shè)計(jì)下游以notl酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基為5' 末端的正向 P5 引物：gccgcggccgcggggcggaattcgttat，
[0029] 及其反向互補(bǔ)引物 P4 :ataacgaattccgccccgcggccgcggc ;
[0030] 6)以 pUC18-E3gp-19K 為模板，P1、P2 為上下游引物，PCR 得到以 Hindlll/snal 為 首尾的含有E3gp-19K啟動(dòng)子增強(qiáng)子區(qū)域序列的DNA產(chǎn)物；
[0031] PCR條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火55°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0032] 7)以pUC18-E3gp-19K為模板，P3、P4為上下游引物，PCR得到以snal/notl為首 尾的含有E3gp-19K編碼區(qū)序列的DNA產(chǎn)物；
[0033] PCR條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火60°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0034] 8)以pUC18-E3gp-19K為模板，P5、P6為上下游引物，PCR得到以notl/EcoRI為首 尾的含有E3gp-19K編碼后方3 '無(wú)義區(qū)的DNA產(chǎn)物；
[0035] PCR條件為：預(yù)變性95°C 5分鐘，變性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循環(huán)34次，最后延伸72°C 10分鐘；
[0036] 9)將上述3種DNA產(chǎn)物分別以各自首尾酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，并將 pUC18-E3gp-19K以HindIII及EcoRI進(jìn)行雙酶切并回收pUC18載體，經(jīng)回收共得到4段兩 端均為粘性末端的DNA片段；
[0037] 10)以連接酶將這4段DNA以Hindlll/snal/notl/EcRI的順序連接成環(huán)，轉(zhuǎn)入大 腸桿菌并挑選單克隆，經(jīng)過(guò)酶切鑒定及測(cè)序鑒定得到陽(yáng)性克隆，即為導(dǎo)入有snal/notl酶 切位點(diǎn)的pUC18-E3gp-19K新序列；
[0038] 11)將P16CDS序列的PCR產(chǎn)物及導(dǎo)入snal/notl酶切位點(diǎn)的pUC18-E3gp-19K新 序列用snal以及notl雙酶切；
[0039] 12)連接酶連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)單克隆篩選、酶切與測(cè)序鑒定，陽(yáng)性克隆即為 含有E3gp-19K啟動(dòng)增強(qiáng)子及P16CDS序列的pUC18-P16 ;
[0040] 13)將Ad5溶瘤腺病毒及上面得到的pUC18-P16用Pmel酶切，并于BJ5183細(xì)胞 內(nèi)進(jìn)行同源重組，挑選單克隆，經(jīng)酶切與測(cè)序鑒定得到鑒定為陽(yáng)性的克隆，即為高效表達(dá)人 P16基因的重組人溶瘤腺病毒Ad5-P16。
[0041] 本發(fā)明還提供了一種具有腫瘤組織靶向性和抑癌基因修復(fù)性的重組溶瘤腺病毒 Ad5-P16在腫瘤細(xì)胞內(nèi)能特異性增殖并殺傷腫瘤細(xì)胞及其抗腫瘤的中應(yīng)用。
[0042] 本發(fā)明的原理
[0043] 1)溶瘤腺病毒除了自身可以通過(guò)特