用于預(yù)防和/或治療埃博拉病毒性出血熱的小核酸分子、dna 分子、蛋白及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于預(yù)防和/或治療埃博拉病毒 性出血熱的小核酸分子、DNA分子、蛋白以及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 病毒性出血熱泛指由數(shù)類病毒引起的、常伴以出血癥狀的一種嚴(yán)重疾病。按照病 原分屬四科，即沙粒病毒科(拉沙熱、胡寧和普馬拉)、布尼亞病毒科(克里米亞-剛果出血 熱、裂谷熱、漢坦出血熱）、線狀病毒科(埃博拉和馬爾堡）以及黃病毒科(黃熱病、登革出血 熱、鄂木斯克出血熱、基薩那森林病)。
[0003] 以上各種病毒性出血熱雖然在病原體、寄生宿主和傳播途徑上各有差異，但都具 有發(fā)熱、出血傾向及腎臟損害的主要臨床特征，都屬于急性病毒性傳染病。目前均無特效療 法,采用對癥和支持療法,糾正水和電解質(zhì)平衡,必要時補(bǔ)液、輸血和抗休克治療。
[0004] 其中，埃博拉出血熱因其病原體是埃博拉病毒，也叫埃博拉病毒病，是目前已知的 毒性最大的病毒性疾病之一，病死率高達(dá)50 - 90%。目前已確定了埃博拉病毒的5個亞 型：埃博拉-扎伊爾型（EBO-Zaire，ΖΕΒ0)、埃博拉-蘇丹型（EBO-Sudan，SEB0)、埃博拉-萊 斯頓型（EBO-R，REB0)和埃博拉-科特迪瓦型（EBO-CI，ICEB0)，埃博拉-本迪布烏干達(dá)型 (EBO-Bundibugyo Uganda，ΒΕΒ0)，其中 ZEBO 致病性最強(qiáng)。
[0005] 埃博拉病毒可以通過接觸傳播，傳播速度很快?；颊咭坏┌l(fā)病，可在24小時內(nèi)死 亡。主要癥狀可表現(xiàn)為高熱、頭痛、惡心、嘔吐、腹瀉、體內(nèi)外大出血、全身酸痛等。它屬于生 物安全等級四級（BSL-4)的病毒，具有極高的生物危險性。
[0006] 埃博拉病毒的宿主尚未確定，最初被認(rèn)為是嚙齒類動物，但實驗后很快被否認(rèn)。實 驗人員發(fā)現(xiàn)，感染病毒后的蝙蝠一般不會死亡，因此推斷其傳染源為帶有病毒的蝙蝠及蝙 蝠的排泄物。但這只是推測，是否為蝙蝠還有待確定。
[0007] 從遺傳角度來看，埃博拉病毒屬于單股負(fù)鏈RNA病毒，其基因組約19kb，具有7個 基因：NP、vp35、vp40、gp、vp30、vp24 和 L，其中 NP, VP30, VP35 和 RNA 依賴的 RNA 聚合酶構(gòu) 成病毒體的中心，即核糖核蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。VP40和VP24負(fù)責(zé)核殼 體的形成，病毒的出芽和包裝以及決定宿主范圍。在這些編碼的蛋白質(zhì)中，GP表面糖蛋白 可能介導(dǎo)埃博拉病毒和靶細(xì)胞的結(jié)合和融合，在埃博拉出血熱的發(fā)病機(jī)理中起非常重要的 作用。將GP單獨轉(zhuǎn)到人源化細(xì)胞或其他幾種非人源化細(xì)胞中，會導(dǎo)致細(xì)胞變圓、脫落，細(xì)胞 表面粘附因子下調(diào)；將GP轉(zhuǎn)入到人或豬血管中，會增加血管的通透性，從而導(dǎo)致血管出血。
[0008] 但由于從血樣中檢測特異的抗原或病毒的基因，或通過細(xì)胞培養(yǎng)分離或者檢測病 毒的IgM和IgG抗體的實驗都有嚴(yán)重的生物危害，必須在最大限度地保證生物安全的條件 下才能進(jìn)行，所以，到目前為止，商業(yè)上也沒有針對病毒感染建立起特異的診斷方法。
[0009] 在埃博拉出血熱的治療方面，一般的抗病毒藥物包括利巴韋林和干擾素都對埃博 拉病毒無效。盡管有實驗顯示，凝固干擾素在感染埃博拉病毒的猴群中似乎可以起一些作 用，但凝固干擾素在人體的效果如何尚未確定。此外，目前也尚無對人類有效的疫苗，埃博 拉出血熱的康復(fù)者的血清也沒有太大的作用，甚至有可能帶來更壞的影響。目前的治療仍 以支持治療為主，如使病毒的侵入最小化，或及時補(bǔ)充損失的血小板，平衡電解質(zhì)，保持血 液中氧元素含量以及對并發(fā)癥的治療等?，F(xiàn)今唯一的治療方法為注射NPCl阻礙劑，因埃博 拉病毒需透過NPCl進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行自我復(fù)制，NPCl蛋白于細(xì)胞間進(jìn)行運輸膽固醇，但阻礙 劑會阻擋膽固醇的運輸路線造成尼曼匹克癥。因此，還需要通過更多更廣泛的研究思路來 尋找預(yù)防和治療埃博拉出血熱疾病方面的藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明旨在提供一種用于預(yù)防和/或治療出血熱的小核酸分子、DNA分子、蛋白以 及它們在藥物篩選中的應(yīng)用，并提供了一種預(yù)防和/或治療出血熱的藥物研發(fā)的新思路。 [0011] 需要說明的是，本發(fā)明是基于【背景技術(shù)】部分所提到的各種病毒性出血熱所引起的 血管結(jié)構(gòu)和功能異常而導(dǎo)致的滲血、出血這一共同癥狀的前提下，通過大量研究而得到的 結(jié)果。因此，本發(fā)明下面所提到的以埃博拉病毒為主要研究對象得到的能夠抑制或緩解上 述癥狀的各種物質(zhì)也適用于上述其他病毒性出血熱。
[0012] 由于血管內(nèi)皮細(xì)胞是埃博拉病毒的主要攻擊的對象之一，血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血 管通透性和體液平衡方面發(fā)揮著重要作用，在埃博拉病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞后，通常引起 血管結(jié)構(gòu)和功能的異常，進(jìn)而導(dǎo)致埃博拉出血熱彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC)。由于人臍靜脈 (human umbilical vein,HUV)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的常用來源，其供源豐富，取材方便，血管條 件優(yōu)越，混雜其他細(xì)胞較少，可獲得細(xì)胞免疫原性較低的血管內(nèi)皮細(xì)胞，可使實驗條件和所 獲結(jié)果更符合人體情況。因此，本發(fā)明在進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞實驗時，選用人臍靜脈血管內(nèi)皮 細(xì)胞作為細(xì)胞模型來進(jìn)行研究。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于預(yù)防和/或治療埃博拉病毒性出血熱的 小核酸分子，該小核酸分子為埃博拉病毒感染細(xì)胞差異化表達(dá)的微小RNA的抑制物和/或 該微小RNA前體的抑制物。
[0014] 進(jìn)一步地，上述小核酸分子是序列為SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5或者SEQ ID NO. 6的微小RNA及其前體的抑制物。
[0015] 進(jìn)一步地，上述小核酸分子的序列與SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11或者SEQ ID NO. 12具有80%以上的同源性，優(yōu)選具有95%以上的 同源性，更優(yōu)選地，上述小核酸分子的序列為SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、或者 SEQ ID NO. 12。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種上述小核酸分子在制備用于預(yù)防和/或治 療鄂木斯克出血熱、基薩那森林病、克里米亞出血熱、新疆出血熱、登革出血熱、基孔肯雅 熱、黃熱病、阿根廷出血熱、玻利維亞出血熱、拉沙熱、流行性出血熱或者馬爾堡病的藥物中 的應(yīng)用。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了一種用于預(yù)防和/或治療埃博拉病毒性出血熱 的藥物，該藥物包括治療有效量的上述小核酸分子。
[0018] 進(jìn)一步地，上述藥物進(jìn)一步包括一種或多種用于預(yù)防和/或治療埃博拉病毒性出 血熱有效物質(zhì)，優(yōu)選地，上述用于預(yù)防和/或治療埃博拉病毒性出血熱有效物質(zhì)選自抗病 毒類藥物、免疫提升類藥物及皮質(zhì)激素類藥物。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種上述小核酸分子在體外抑制埃博拉病毒性出 血熱感染引起細(xì)胞生長脫落的應(yīng)用，在細(xì)胞感染埃博拉病毒之前或之后，將上述小核酸分 子轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種上述小核酸分子在體外篩選用于預(yù)防和/或 治療埃博拉病毒性出血熱的藥物中的應(yīng)用，將上述小核酸分子與待測藥物進(jìn)行核酸同源性 比對。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了一種DNA分子，上述DNA分子在埃博拉病毒感染 細(xì)胞中的表達(dá)水平被上述一種或多種小核酸分子上調(diào)。
[0022] 進(jìn)一步地，上述DNA分子的序列與SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27,SEQ IDN0·28、SEQIDN0·29、SEQIDN0·30、SEQIDN0·31或者SEQIDN0·32具有80%以上的 同源性，優(yōu)選具有95%以上的同源性，更優(yōu)選地，上述DNA分子的序列為SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 或 者 SEQ ID NO. 32。
[0023] 進(jìn)一步地，上述 DNA 分子為序列為 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 20、 SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 或者 SEQ ID NO. 32,優(yōu)選序列 為 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 23 或者 SEQ ID NO. 24。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了一種上述DNA分子在體外篩選用于預(yù)防和/或 治療埃博拉病毒性出血熱的藥物中的應(yīng)用。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了一種上述DNA分子編碼的蛋白，上述蛋白的序 列與 SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38,SEQ ID NO. 39,SEQ ID NO. 40,SEQ ID NO. 4USEQ ID NO. 42,SEQ ID NO. 43,SEQ ID NO. 44,SEQ ID NO. 45,SEQ ID NO. 46,SEQ ID NO. 47,SEQ ID NO. 48,SEQ ID NO. 49,SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51或者SEQ ID NO. 52具有80%以上的同源性，優(yōu)選具有95%以上的同 源性，更優(yōu)選地，上述蛋白的序列為SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36,SEQ ID NO. 37,SEQ ID NO. 38,SEQ ID NO. 39,SEQ ID NO. 40,SEQ ID NO. 4USEQ ID NO. 42,SEQ ID NO. 43,SEQ ID NO. 44,SEQ ID NO. 45,SEQ ID NO. 46,SEQ ID NO. 47,SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51 或者 SEQ ID NO. 52。
[0026] 進(jìn)一步地，上述蛋白的序列為 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 40、SEQ IDN0·43、SEQIDN0·44、SEQIDN0·46、SEQIDN0·47或者SEQIDN0·52，優(yōu)選序列為SEQID NO. 34、SEQ ID NO. 43 或者 SEQ ID NO. 44。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了一種上述蛋白在體外篩選用于預(yù)防和/或治療 埃博拉病毒性出血熱的藥物中的應(yīng)用。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了一種用于檢測埃博拉病毒性出血熱的試劑盒， 該試劑盒包括可特異性擴(kuò)增上述小核酸分子所抑制的微小RNA的引物。
[0029] 進(jìn)一步地，當(dāng)微小RNA的序列為SEQ ID NO. 1時，逆轉(zhuǎn)錄引物序列為SEQ ID NO. 140 :GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTGCT，熒光實時定量 PCR 所 用到的引物：FP 序列為 SEQ ID NO. 146 :CCGCGCAATGGATTTTT，RP 序列為 SEQ ID NO. 147 : GTGCACGCTCCGAGGT ；
[0030] 當(dāng)微小RNA的序列為SEQ ID NO. 2時，逆轉(zhuǎn)錄引物序列為SEQ ID NO. 141 :G TCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCAAC，熒光實時定量 PCR 所用到 的引物：FP 序列為 SEQ ID NO. 148 :CCGCGCTAGGTAGTTTCCT，RP 序列為 SEQ ID NO. 149 : GTGCACGCTCCGAGGT ；
[0031] 當(dāng)微小RNA的序列為SEQ ID NO. 3時，逆轉(zhuǎn)錄引物序列為SEQ ID NO. 142 :GTCGT ATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGCCC，熒光實時定量 PCR 所用到的引物：FP 序列為 SEQ ID NO. 150 :TCGCGCAAAAGCTGG，RP 序列為 SEQ ID NO. 151 :GTGCACGCTCCGAGGT ;
[0032] 當(dāng)微小RNA的序列為SEQ ID NO. 4時，逆轉(zhuǎn)錄引物序列為SEQ ID NO. 143 :GTCGT ATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTAGA，熒光實時定量 PCR 所用到的引物：FP 序列為 SEQ ID NO. 152 :TCGCGCTCGAGGAGC，RP 序列為 SEQ ID NO. 153 :GTGCACGCTCCGAGGT ;
[0033] 當(dāng)微小RNA的序列為SEQ ID NO. 5時，逆轉(zhuǎn)錄引物序列為SEQ ID NO. 144 :GTCGTA TCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACC.，熒光實時定量 PCR 所用到的引物：FP 序列為 SEQ ID NO. 154 :TCGCGCTGGCAGTGT，RP 序列為 SEQ ID NO. 155 :GTGCACGCTCCGAGGT ;
[0034] 當(dāng)微小RNA的序列為SEQ ID NO. 6時，逆轉(zhuǎn)錄引物序列為SEQ ID NO. 145 :GTCGT ATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCTGT，熒光實時定量 PCR 所用到的引物：FP 序列為 SEQ ID NO. 156 :TCGCGCTGCGGG，RP 序列為 SEQ ID NO. 157 :GTGCACGCTCCGAGGT。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了一種用于檢測埃博拉病毒性出血熱的試劑盒， 該試劑盒包括可特異性擴(kuò)增上述DNA分子的引物。
[0036] 進(jìn)一步地，當(dāng)DNA分子的序列為SEQ ID NO. 13時，引物的FP序列為SEQ ID NO. 100 :AAGCAGGATCTTCTAAGGTT，RP 序列為 SEQ ID NO. 101 :AGTGTTGTTCTTGGTCTCTC ; 當(dāng)DNA分子的序列為SEQ ID NO. 14時，引物的FP序列為SEQ ID NO. 102 : GTCACTTGCTTCCTTACTTAG，RP 序列為 SEQ ID NO. 103 :TGAGCCATAACCACAGAG ;當(dāng) DNA 分子 的序列為 SEQ ID NO. 15 時，引物的 FP 序列為 SEQ ID NO. 104 :ACCAATCAGTGCTCAGTAT， RP 序列為 SEQ ID NO. 105 :TCAACCTCCACATCTCTATC ;當(dāng) DNA 分子的序列為 SEQ ID NO. 16 時，引物的 FP 序列為 SEQ IDN0. 106 :TGGTCATCATCTGCTTGTG，RP 序列為 SEQ ID NO. 107 : TTCCTATTCGGTCACTCTCT ;當(dāng)DNA分子的序列為SEQ ID NO. 17時，引物的FP序列為SEQ ID NO. 108 :GGTAGAACTGAACAACGATAG，RP 序列為 SEQ ID NO. 109 :CAGCAATGGTATAGCAACTT ; 當(dāng)DNA分子的序列為SEQ ID NO. 18時，引物的FP序列為SEQ ID NO. 110 : CGACGAACAGTAGACAGTATT，RP 序列為 SEQ ID NO. Ill :CAGCAATTCCATCTTCATCACT ;當(dāng) DNA 分 子的序列為 SEQ ID NO. 19 時，引物的 FP 序列為 S