一種水稻花藥特異表達啟動子OsAnth1的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種水稻 花藥特異表達啟動子OsAnthl及其應用，該啟動子能夠在水稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中驅(qū)動目標 基因在水稻花藥中特異表達。
【背景技術(shù)】
[0002] 外源DNA序列通過連接到特定的啟動子從而啟動在植物宿主中的表達，啟動子類 型的選擇決定基因的表達時間和部位。植物基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的，受多種 順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)。啟動子是重要的順式作用元件，是位于結(jié)構(gòu)基 因5'端上游區(qū)域調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確 地結(jié)合，確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起關(guān)鍵作用。根據(jù)其驅(qū)動基因表達的不 同特點，啟動子分為組成型啟動子和特異性啟動子。組成型啟動子能在所有細胞或組織中， 不分時間和空間地啟動轉(zhuǎn)錄。
[0003] 目前在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應用的主要是一些組成型啟動子，比如CaMV35S啟 動子和玉米Ubiquitin-I啟動子，然而在利用這些啟動子誘導目的基因轉(zhuǎn)化水稻等作物以 期改良作物的品質(zhì)時，往往會由于目的基因表達的時間（發(fā)育階段特異性）或空間（組織 器官特異性）不能很好地控制而導致改良效果不明顯，或者由于這些組成型啟動子誘導基 因表達量太高而對植物的生長發(fā)育造成影響，這些都是目前利用組成型強啟動子結(jié)合功能 基因來改良作物品質(zhì)時遇到的障礙。
[0004] 特異性啟動子可以在特定的條件、部位或者時段集中表達。特異性啟動子又可分 為組織特異型啟動子和誘導型啟動子，其中誘導型啟動子平時不啟動轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄活性很 低，但在某些特定的逆境信號的刺激下，轉(zhuǎn)錄活性能夠顯著地提高。
[0005] 隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物在全球的大面積推廣，啟動子在轉(zhuǎn)基因中的重要性得到廣泛的 共識。水稻花藥是水稻雄性配子花粉產(chǎn)生的器官，與水稻穗的發(fā)育、育種及水稻的產(chǎn)量等密 切相關(guān)。因此在水稻組織特異啟動子的研宄領(lǐng)域中，花藥特異性啟動子是人們最為關(guān)注的 啟動子之一。
[0006] 但是目前人們所發(fā)現(xiàn)的花藥特異性啟動子的遺傳資源并不是十分豐富，限制了人 們對花藥性狀改良能力的提升。
[0007] 因此，本發(fā)明希望分離到一種水稻花藥特異性表達的啟動子，以用于驅(qū)動在花藥 中特異性表達一些功能基因或結(jié)構(gòu)基因，達到品種改良的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動外源基因在水稻花藥中特異性表達 的啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉(zhuǎn)化子以及該啟動子的應用。
[0009] 具體而言，本發(fā)明提供一種花藥特異性強表達啟動子，所述水稻花藥強表達啟動 子包含：
[0010] 1)序列表中SEQID NO: 1所示的DNA分子；或者
[0011] 2)在嚴格條件下與SEQID NO: 1中的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子； 或者
[0012] 3)與1)或2)中所限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有啟動子功能的 DNA分子。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的水稻花藥特異性強表達啟動子由SEQ ID No: 1所示的序列 構(gòu)成。
[0014] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)的花藥特異性強表達啟動子，本文中稱為OsAnthl或啟動子OsAnthl。具體 而言，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基因上游包括轉(zhuǎn) 錄起始位點在內(nèi)的1753bp的DNA序列，具有驅(qū)動目標基因水稻花藥中特異性表達的功能， 并且分離克隆、并鑒定了該DNA序列的功能。
[0015] 另一方面，本發(fā)明還提供一組擴增權(quán)利要求1或2所述的水稻花藥特異性強表達 啟動子的全部或其任意片段的引物對，其特征在于，所述引物對包括正向引物和反向引物， 所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所述，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
[0016] 另一方面，本發(fā)明還提供含有權(quán)利要求1所述水稻花藥特異性強表達啟動子的 重組載體或表達盒，在所述重組載體或表達盒中，權(quán)利要求1所述的水稻花藥特異性強表 達啟動子連接于待表達基因的上游，所述待表達基因包括具有改變水稻花藥性狀能力的基 因。
[0017] 又一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達載體，所述重組表達載體包含上述的水稻 花藥特異性強表達啟動子，在所述重組表達載體中，所述水稻花藥特異性強表達啟動子連 接于待表達的基因序列的上游。在一種實現(xiàn)方式中，所述待表達的基因為Gus基因。該重組 表達載體為將SEQ ID No: 1所示的序列即OsAnthl或啟動子OsAnthl構(gòu)建于pCAMBIA1391 中得到的重組表達載體，本文中稱為pCAMBIA1391-〇sAnthl?；蛘叽磉_基因可以為任何對 水稻花藥具有改善功能的基因。
[0018] 另一方面，本發(fā)明還提供一種利用該啟動子獲得宿主菌的方法。所述宿主菌為將 本發(fā)明提供的上述水稻花藥特異性強表達啟動子、上述表達盒、或上述重組表達載體轉(zhuǎn)入 根癌農(nóng)桿菌而獲得。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供一種利用該啟動子獲得轉(zhuǎn)化子的方法。所述轉(zhuǎn)化子為將本 發(fā)明提供的上述水稻花藥特異性強表達啟動子、上述表達盒、上述重組表達載體、或上述宿 主菌轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因細胞系、愈傷組織或植株而獲得。
[0020] 再一方面，本發(fā)明提供上述水稻花藥特異性強表達啟動子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的 應用。所述應用包括將本發(fā)明提供的上述水稻花藥特異性強表達啟動子連接于載體的待 表達的基因序列上游（例如，將所述啟動子序列置于目標基因之前），從而構(gòu)建重組表達載 體，將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
[0021] 并且優(yōu)選地，所述應用可以用于改良植物生長特性，尤其是水稻的花藥生長特性。 所述植物為單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高梁或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0022] 需要說明的是，本發(fā)明所提供的啟動子序列中，序列開頭的 "AAAATCCACCCATTGCCTCCAG"為獲得啟動子過程中使用的正向引物的留存序列，共計22bp ; 序列末尾的序列" TCCTCCTCCGTCGTTCGCGTGC"為獲得啟動子過程中使用的反向引物的留存 序列（該留存序列與反向引物的相應序列互補），共計22bp ;該DNA序列中剩余的部分則為 獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強調(diào)的是，本文中所提到的啟動子既可以指上述整個 DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要說明的是，即便本領(lǐng)域技術(shù) 人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0023] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare) OsAnthl基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點在內(nèi)的1753bp的DNA序列，并將其命 名為啟動子OsAnthl。將該序列經(jīng)酶切后連接到植物雙元表達載體pCAMBIA1391上，獲得相 應的重組質(zhì)粒（即重組表達載體），利用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng) 桿菌介導的方法進行水稻的轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進行Gus組 織化學染色檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的花藥部位Gus基因顯著表達，而其他部位如根莖葉等 中均沒有明顯的GUS活性，從而證明該1753bp的序列具有驅(qū)動基因在花藥部位特異性表達 的活性。
[0024] 本發(fā)明所述的啟動子序列可與植物雙元表達載體連接，用于取代組成型啟動子。 并且，該啟動子序列可以與所需的靶標基因連接，構(gòu)建重組植物表達載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，在水 稻的花藥部位特異性的驅(qū)動靶標基因的表達，增加轉(zhuǎn)基因的效果，避免不必要部位表達帶 來的物質(zhì)能量浪費，有效改良水稻的特性。
[0025] 技術(shù)效果
[0026] 本發(fā)明所克隆的水稻啟動子OsAnthl能夠調(diào)控基因在水稻花藥中特異性集中表 達，在實際應用中具有顯著價值。通過該啟動子對農(nóng)作物品種進行基因改造改善植物花藥 的生長特性，如通過該啟動子驅(qū)動目標基因在植株中表達，例如，可以增強花藥發(fā)育過程中 對環(huán)境的抵抗力，比如耐寒性、耐熱性等等，從而培育出理想的轉(zhuǎn)基因植物品種。
【附圖說明】
[0027] 以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：
[0028] 圖1為將OsAnthl啟動子構(gòu)建于pCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖，其中圖1中A 為PCAMBIA1391示意圖，圖1中B為pCAMBIA1391-〇sAnthl示意圖，其中示出了利用OsAnthl 啟動子驅(qū)動位于其下游的Gus基因表達；
[0029] 圖2為對本發(fā)明啟動子進行酶切驗證的結(jié)果示意圖；
[0030] 圖3為12周苗齡的OsAnthl::⑶S轉(zhuǎn)基因植株組織染色圖（標尺=5mm)。
【具體實施方式】
[0031] 以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅 用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施