對(duì)Bt毒素具有殺蟲(chóng)增效作用的小菜蛾堿性磷酸酶基因蛋白片段PxALP1及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬農(nóng)業(yè)微生物學(xué)應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)具有殺蟲(chóng)增效作用的小菜蛾 堿性磷酸酶基因片段的分離、克隆及其編碼的多肽片段在Bt殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt)在產(chǎn)生芽孢的同時(shí)產(chǎn)生一種晶 體包涵體，其體內(nèi)是δ內(nèi)毒素的殺蟲(chóng)晶體蛋白，又稱Bt晶體毒素。Bt晶體毒素被敏感昆 蟲(chóng)幼蟲(chóng)取食后，在其幼蟲(chóng)腸道堿性環(huán)境和蛋白酶的作用下被激活，釋放出活性毒素蛋白，后 與幼蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合形成毒素寡聚體，誘導(dǎo)毒素分子的空間構(gòu)象發(fā)生變 化，多個(gè)毒性肽分子在細(xì)胞膜中聚集圍成外表面疏水、內(nèi)表面親水的膜離子通道，進(jìn)而引起 細(xì)胞滲透平衡破壞、細(xì)胞吸脹破裂，最后導(dǎo)致腸壁破裂昆蟲(chóng)死亡。
[0003] Bt晶體毒素對(duì)靶標(biāo)害蟲(chóng)具有高度的專一性，是目前世界上產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣泛 的微生物殺蟲(chóng)劑，已廣泛應(yīng)用于微生物制劑和轉(zhuǎn)基因植物中。2012年，在我國(guó)126家企業(yè)的 生物農(nóng)藥出口中，Bt產(chǎn)值已達(dá)1160萬(wàn)美元，與阿維菌素及赤霉酸一起共為8777萬(wàn)美元，占 所有生物農(nóng)藥出口的51 %。Bt殺蟲(chóng)范圍包括節(jié)肢動(dòng)物門的鱗翅目（L印idoptera)、雙翅目 (Diptera)、鞘翅目（Coleoptera)和直翅目（Orthoptera)等，其對(duì)線形動(dòng)物門和原生動(dòng)物 門的某些種類亦有毒殺活性。通過(guò)各種策略來(lái)提高殺蟲(chóng)晶體蛋白的活性，對(duì)高效Bt工程菌 的構(gòu)建和cry基因在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用具有非常重要的意義。
[0004] Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白用于商業(yè)性控制農(nóng)業(yè)及衛(wèi)生害蟲(chóng)已有60余年，自1996年轉(zhuǎn)Bt基 因作物被采納以來(lái)，至2013年，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1. 752億公頃，其中印度Bt 棉花種植面積創(chuàng)歷史新高，達(dá)到1100萬(wàn)公頃，采用率為95%;中國(guó)小農(nóng)戶種植了 420萬(wàn)公頃 的Bt棉花，采用率為90%;五個(gè)歐盟國(guó)家Bt玉米的種植面積達(dá)到創(chuàng)紀(jì)錄的148013公頃，比 2012年增加18942公頃。Bt作物的合理輪作及抗性管理是十分必要也是各國(guó)一直關(guān)注的 問(wèn)題，Bt抗性持續(xù)的增長(zhǎng)，則可能無(wú)法控制某些重大病蟲(chóng)害的發(fā)展，造成難以估計(jì)的損失。
[0005] 而B(niǎo)t殺蟲(chóng)蛋白增效物質(zhì)的研宄則能更好地促進(jìn)其殺蟲(chóng)效率，減少農(nóng)藥使用量，延 緩抗性的產(chǎn)生。除殺蟲(chóng)晶體蛋白和外毒素起殺蟲(chóng)作用外，還有許多與殺蟲(chóng)相關(guān)的增效物 質(zhì)，如幾丁質(zhì)酶、Cyt 蛋白、營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs)、 輔助蛋白（Accessary proteins)P19、P20、P21 和 Zwittermicin A 等。近年來(lái)，經(jīng)研宄還 發(fā)現(xiàn)媽粘蛋白片段（Cadherin)、氨肽酶氮（Aminopeptidase N)及堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase)等均能增強(qiáng)Cry毒素對(duì)昆蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性。按增效物質(zhì)作用機(jī)理不同，可將其 分為三類：1.改進(jìn)毒素的錨定和膜的插入，如Cyt蛋白、氨肽酶氮及堿性磷酸酶等；2.通過(guò) 破壞昆蟲(chóng)中腸的圍食膜來(lái)增加毒素的通透性，如鈣粘蛋白片段等；3.破壞對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)所必 須的細(xì)菌中腸免疫性，分解作為昆蟲(chóng)的中腸圍食膜、上皮，破壞幼蟲(chóng)這道天然屏障，使病毒、 細(xì)菌等更容易侵入幼蟲(chóng)體內(nèi)，引起幼蟲(chóng)死亡，如幾丁質(zhì)酶、Zwittermicin A等。此外，通過(guò) 對(duì)毒素基因進(jìn)行改造或?qū)ζ溥M(jìn)行定點(diǎn)突變，在Cry蛋白的特定區(qū)域引入水解位點(diǎn)或者刪除 N末端片段等方面的改造也可達(dá)到增效目的。
[0006] 堿性磷酸酶作為CrylA毒素的受體，可促進(jìn)毒素對(duì)膜的插入和孔道形成。諸多從 雙翅類和鱗翅類昆蟲(chóng)物種中分離出來(lái)的堿性磷酸酶已被鑒定為CrylAc和CryllAa毒素的 受體。陳文波等的研宄表明，棉鈴蟲(chóng)（EU729323)中腸堿性磷酸酶多肽對(duì)CrylAc毒素具有 一定的增效作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在于針對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)對(duì)Bt抗性強(qiáng)的現(xiàn)狀，提供一種對(duì)Bt毒素具有殺蟲(chóng) 增效作用的小菜蛾堿性磷酸酶基因蛋白片段PxALPl及應(yīng)用，本發(fā)明從小菜蛾體內(nèi)克隆了 一種新型的增效因子堿性磷酸酶片段PxALPO，通過(guò)原核表達(dá)與毒力測(cè)定，表明該堿性磷酸 酶片段PxALPO編碼的多肽片段具有顯著提高Bt晶體蛋白殺蟲(chóng)活性的功能。
[0008] 為達(dá)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種對(duì)Bt毒素具有殺蟲(chóng)增效作用的 小菜蛾堿性磷酸酶基因蛋白片段PxALPl，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0009] 本發(fā)明同時(shí)提供一種編碼上述蛋白的基因 PxALPO,其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0010] 上述提及的堿性磷酸酶基因片段從小菜蛾（PlUtella xylostella)中克?。ㄉ暾?qǐng) 人將其命名為PxALPO)。經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)該P(yáng)xALPO由967個(gè)堿基組成，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。序列分析發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的PxALPO編碼了由322個(gè)氨基酸殘基組成的多肽片段 PxALPl，該多肽序列如SEQ ID No. 2所示。通過(guò)原核表達(dá)及室內(nèi)毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基 因 PxALPO原核表達(dá)后的PxALPl蛋白，可顯者提尚CrylAc殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)小采蛾的殺蟲(chóng)活 性。
[0011] 本發(fā)明的堿性磷酸酶片段PxALPO可用于轉(zhuǎn)化微生物等，使之表達(dá)出具有增效作 用的多肽PxALPl，從而可顯著提高殺蟲(chóng)晶體蛋白的殺蟲(chóng)活性，并可克服或延緩小菜蛾等鱗 翅目害蟲(chóng)對(duì)Bt制劑或Bt轉(zhuǎn)基因植物的抗性，在鱗翅目害蟲(chóng)的防治方面具有極為廣泛的應(yīng) 用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例中PCR的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0013] 其中，M :100bp plus DNA Ladder分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 :堿性磷酸酶基因片段PxALPO的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0014] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例構(gòu)建的克隆載體PxALP-Tl的物理圖譜。
[0015] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中超量表達(dá)載體PxALP_6p的構(gòu)建圖及其物理圖譜。
[0016] 圖4是本發(fā)明克隆的堿性磷酸酶基因片段PxALPO的原核超量表達(dá)產(chǎn)物（PxALPl) 經(jīng)純化后的SDSPage電泳圖；
[0017] 其中，M:15-150kDa雙色預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1:空載體pGEX-6p-l表達(dá)菌株P(guān)GEXO誘導(dǎo) 培養(yǎng)物中親和層析純化的GST蛋白；2 :PGALP菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)物裂解后上清中的GST融合蛋 白；3 :吸附后上清中的GST融合蛋白；4 :第一次洗滌后上清；5 :第二次洗滌后上清；6 :第 三次洗滌后上清；7 :純化后的GST-PxALPl融合蛋白。
[0018] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例中增效蛋白PxALPl與殺蟲(chóng)晶體蛋白配比后生物測(cè)定結(jié)果分 析圖。
[0019] 其中，橫坐標(biāo)為不同處理，圖中不同的字母表示各處理之間在0.01水平上差異顯 著。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下僅為本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明具有說(shuō)明作用，但無(wú)限制作用。有關(guān)DNA的標(biāo) 準(zhǔn)操作方法和所使用的藥品均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所描述的內(nèi)容（參見(jiàn)J.薩姆布魯 克等，2002,分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，金冬雁等（譯），科學(xué)出版社，北京）。本發(fā)明中所 涉及的其它各種實(shí)驗(yàn)操作，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。
[0021] 實(shí)施例1小菜蛾堿性磷酸酶基因片段PxALPO的克隆
[0022] 本發(fā)明以小菜蛾幼蟲(chóng)作為堿性磷酸酶基因片段PxALPO的來(lái)源。
[0023] 1、小菜蛾幼蟲(chóng)中腸總RNA的抽提及檢測(cè)
[0024] 所用小菜蛾為CrylAc-S敏感品系，于室內(nèi)飼養(yǎng)多年，期間從未施用過(guò)任何殺蟲(chóng) 劑。取3齡健康小菜蛾幼蟲(chóng)數(shù)頭，取中腸，按照TRIzoL抽提法提取小菜蛾幼蟲(chóng)中腸總RNA， 具體步驟如下：
[0025] (1)用鑷子將所有中腸轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的研磨器中，加入適量Trizol (TaKaRa，），后在 冰上研磨成勻漿。
[0026] (2)渦旋混勻后室溫靜置5min，12000 X g 4°C，離心5min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新 的I. 5mlEP管中。
[0027] (3)加入l/5Trizol體積量預(yù)冷的氯仿，震蕩混勻，室溫下靜置5min，12000Xg 4°C，離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，注意不要吸入雜質(zhì)。
[0028] (4)在上清液中加入等量體積預(yù)冷的異丙醇于室溫靜置10min，12000Xg4°C，離 心 IOmin0
[0029] (5)將上清棄之，向沉淀中加入與Trizol等體積預(yù)冷的75%的乙醇，渦旋混勻清 洗沉淀，12000Xg 4°C，離心 5min。
[0030] (6)棄上清保留沉淀，讓其空氣自然干燥或真空干燥數(shù)分鐘。
[0031] (7)加入適量的DEPC水溶解沉淀，用槍頭反復(fù)吸打混勻。
[0032] 測(cè)定0D260/0D280的比值為1. 9-2. 0之間，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果顯示抽提 的RNA的濃度為3436. Ong/ μ 1，說(shuō)明抽提的總RNA純度符合實(shí)驗(yàn)要求，樣品存于-80°C備 用。
[0033] 2、反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得堿性磷酸酶基因片段PxALPO
[0034] 合成cDNA采用的是TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa)，按照說(shuō)明書(shū)的方法加 入 1-5 μ g 模板 RNA、1 μ I Oligo dT Primer (50 μΜ)、1 μ I dNTP MixtureQOmM each)，加 RNase free dH20補(bǔ)足至10μ1。吸打混勻后置于65°C溫育5min，立即置于冰上冷卻。然 后在該體系中加入4μ1 5XPrimeSctipt II Buffer、0.5yl RNase Inhibitor(40U/yl)、 I μL PrimeSctipt II RTase (20〇υ/μ1)，加 RNase free dH20 補(bǔ)足至 20 μL。溫和地混勻， 45°C溫育45min后于70°C處理15min，迅速置于冰上，檢測(cè)后存于-20°C備用。
[0035] 獲得小菜蛾中腸 cDNA第一鏈后，根據(jù)己發(fā)表的棉鈴蟲(chóng)中腸堿