Uv相關(guān)聯(lián)的mtrna融合轉(zhuǎn)錄體及其方法和用圖
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年3月1日、申請(qǐng)?zhí)枮?011800118065和發(fā)明名稱為"UV 相關(guān)聯(lián)的MTRNA融合轉(zhuǎn)錄體及其方法和用途"的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本發(fā)明要求2010年3月1日提交的美國申請(qǐng)61/309, 216的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容 通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明涉及線粒體基因組領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及與UV暴露相關(guān)聯(lián)的線粒體融 合轉(zhuǎn)錄體和相關(guān)的缺失分子，以及它們?cè)谏飿悠分械臋z測和監(jiān)測。
【背景技術(shù)】
[0005] 線粒體基因組
[0006] 線粒體基因組是核酸的緊湊并且關(guān)鍵的序列。與33億個(gè)bp的巨大核基因組（單 倍體）相比，線粒體DNA或"mtDNA"包括16569個(gè)核酸堿基對(duì)（bp)的小基因組（Anderson 等人，1981 ;Andrews等人，1999)。mtDNA遺傳互補(bǔ)顯著小于其核細(xì)胞伴侶的遺傳互補(bǔ) (0. 0005% )。然而，根據(jù)特異性的細(xì)胞功能，個(gè)體細(xì)胞攜帶IO3至10 4個(gè)線粒體（Singh和 Modica-Napolitano,2002)。在核基因組和線粒體基因組之間常規(guī)地發(fā)生交流或化學(xué)的 信號(hào)傳遞（Sherratt等人，1997)。此外，特異性核組分負(fù)責(zé)線粒體序列的維護(hù)和完整性 (Croteau等人，1999)。一旦發(fā)生受精，由于線粒體在卵子內(nèi)的克隆增殖，所以給定個(gè)體中所 有mtDNA基因組都是相同的。然而突變事件可能誘導(dǎo)反映為體細(xì)胞突變的序列變異。這些 突變可能在已知為異質(zhì)性的情況下在全身的不同組織內(nèi)積累。
[0007] 線粒體融合轉(zhuǎn)錄組
[0008] 線粒體基因組的不尋常處在于它是圓形的、無內(nèi)含子DNA分子?；蚪M夾雜有具 有特異性長度側(cè)翼序列的重復(fù)基序。這些重復(fù)基序之間的序列傾向于在還沒有被很好理 解的情況下缺失?？紤]到線粒體基因組中重復(fù)基序的數(shù)目，存在很多可能的缺失。最有名 的例子是4977 "共同缺失"。這種缺失已經(jīng)與幾種傳聞中的病癥和疾病相關(guān)聯(lián)，并被認(rèn)為 隨著老化頻率增高（Dai等人，2004 ;Ro等人，2003 ;Barron等人，2001 ;Lewis等人，2000 ; MulIer-Hocker，1998 ;Porteous 等人，1998) 〇
[0009] 各種其他的線粒體缺失已經(jīng)與前列腺癌、皮膚癌和肺癌的早期發(fā)病相關(guān)聯(lián)，以 及與老化（例如Polyak等人，1998)、過早老化和暴露于致癌物質(zhì)（Lee等人，1998)相 關(guān)聯(lián)。另外，研宄人員已發(fā)現(xiàn)，紫外線輻射（UV)在非黑色素皮膚癌（匪SC)的發(fā)展和發(fā) 病機(jī)理中是重要的（Weinstock 1998 ;Rees，1998)，并且UV誘導(dǎo)人皮膚的mtDNA損傷 (Birch-Machin，2000a)。在加拿大專利申請(qǐng)2, 480, 184中，例如線粒體基因組的次要弧區(qū) 中的3895bp缺失被識(shí)別為UV-誘導(dǎo)DNA損傷的生物標(biāo)記。之后3895bp缺失也已經(jīng)與皮膚 癌相關(guān)聯(lián)（PCT 申請(qǐng) PCT/CA2006/000652)。
[0010] 如在申請(qǐng)人的共同待決的國際專利申請(qǐng)PCT/CA2009/000351中討論的，從人線粒 體基因組的大規(guī)模缺失圖譜獲得的知識(shí)已用于識(shí)別與疾病相關(guān)聯(lián)的缺失。線粒體基因組的 計(jì)算機(jī)分析例如已經(jīng)使得申請(qǐng)人能夠識(shí)別缺失位點(diǎn)，在DNA分子中開始缺失事件時(shí)，重新 閉合或重新連接以產(chǎn)生具有開放閱讀框（ORF)的融合的DNA序列。從這些研宄中，申請(qǐng)人 識(shí)別了顯示出與惡性腫瘤相關(guān)的缺失分子和相關(guān)聯(lián)的融合轉(zhuǎn)錄體的亞組。
[0011] 申請(qǐng)人已識(shí)別了與UV暴露相關(guān)聯(lián)的線粒體缺失和融合轉(zhuǎn)錄體的其他亞組。本文 描述了這些研宄的結(jié)果和它們?cè)跈z測UV損傷中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測線粒體融合轉(zhuǎn)錄體的方法。
[0013] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了檢測線粒體融合轉(zhuǎn)錄體的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄體與 UV暴露相關(guān)聯(lián)，所述方法包括以下步驟：(a)提供生物樣品；和（b)檢測所述樣品中線粒體 融合轉(zhuǎn)錄體的存在。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于確定對(duì)象中累積UV暴露的方法，所述方法 包括以下步驟：(a)提供來自對(duì)象的生物樣品；和（b)檢測與UV暴露相關(guān)聯(lián)的線粒體融合 轉(zhuǎn)錄體的存在。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了與UV暴露相關(guān)聯(lián)的分離的線粒體融合轉(zhuǎn)錄體。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合轉(zhuǎn)錄體用于檢測UV暴露的用途。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了融合轉(zhuǎn)錄體作為UV暴露的生物標(biāo)記的用途。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于檢測UV暴露的試劑盒，所述試劑盒包括： (a)探針，其具有與本發(fā)明的分離的融合序列部分基本互補(bǔ)的序列。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了檢測人mtDNA基因組中缺失的方法，其中所述 缺失與UV暴露相關(guān)聯(lián)，所述方法包括以下步驟：(a)提供生物樣品；(b)從所述生物樣品提 取mtDNA ;和（c)檢測mtDNA缺失分子的存在。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于確定對(duì)象中累積UV暴露的方法，所述方法 包括以下步驟：(a)提供生物樣品；(b)從所述生物樣品提取mtDNA ;和（C)檢測與UV暴露 相關(guān)聯(lián)的mtDNA中缺失的存在。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了與UV暴露相關(guān)聯(lián)的分離的mtDNA缺失分子。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了用于檢測UV暴露的mtDNA缺失的用途。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了 mtDNA缺失作為用于UV暴露的生物標(biāo)記的用 途。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了測試皮膚護(hù)理產(chǎn)品對(duì)預(yù)防、最小化、減輕或保護(hù) 免受UV暴露或損傷的功效的方法，所述方法包括以下步驟：(a)準(zhǔn)備具有期望特性的皮膚 護(hù)理產(chǎn)品；(b)將皮膚護(hù)理產(chǎn)品施用至患者皮膚或皮膚等同物；（c)將皮膚或皮膚等同物暴 露于UVR ; (d)檢測暴露的患者皮膚或暴露的皮膚等同物的樣品中與UV暴露相關(guān)聯(lián)的線粒 體融合轉(zhuǎn)錄體的存在；和（e)將轉(zhuǎn)錄體的存在與參照值進(jìn)行比較。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了測試新的皮膚護(hù)理產(chǎn)品或制劑用于預(yù)防、最小 化、減輕或保護(hù)免受UV暴露或損傷的功效的方法，所述方法包括以下步驟：(a)準(zhǔn)備具有期 望特性的皮膚護(hù)理產(chǎn)品；(b)將所述皮膚護(hù)理產(chǎn)品施用于患者皮膚或皮膚等同物；（C)將皮 膚或皮膚等同物暴露于UVR ;(d)檢測經(jīng)暴露的患者皮膚或經(jīng)暴露的皮膚等同物的樣品中 mtDNA缺失分子的存在，其中所述mtDNA缺失分子與UV暴露相關(guān)聯(lián)；和（e)將所述分子的 存在與參照值進(jìn)行比較。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了對(duì)于預(yù)防、最小化、減輕或保護(hù)免受UV暴露或 損傷的能力來篩選皮膚護(hù)理產(chǎn)品的方法，所述方法包括以下步驟：(a)將皮膚護(hù)理產(chǎn)品施 用于患者的皮膚或皮膚等同物；(b)將所述皮膚或皮膚等同物暴露于UVR ; (c)檢測與UV暴 露相關(guān)聯(lián)的線粒體融合轉(zhuǎn)錄體的存在；和（e)將對(duì)于每種經(jīng)測試的皮膚護(hù)理產(chǎn)品的融合轉(zhuǎn) 錄體的存在與參照值進(jìn)行比較和/或互相進(jìn)行比較。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了對(duì)于預(yù)防、最小化、減輕或保護(hù)免受UV暴露或 損傷的能力來篩選皮膚護(hù)理產(chǎn)品的方法，所述方法包括以下步驟：(a)將皮膚護(hù)理產(chǎn)品施 用于患者的皮膚或皮膚等同物；(b)將所述皮膚或皮膚等同物暴露于UVR ; (c)檢測經(jīng)暴露 的患者皮膚或經(jīng)暴露的皮膚等同物的樣品中mtDNA缺失分子的存在，其中所述mtDNA缺失 分子與UV暴露相關(guān)聯(lián)；和（e)將對(duì)于每種經(jīng)測試的皮膚護(hù)理產(chǎn)品的缺失分子的存在與參照 值進(jìn)行比較和/或互相進(jìn)行比較。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了測試皮膚護(hù)理產(chǎn)品用于預(yù)防、減輕或保護(hù)免受 皮膚老化或光老化的功效的方法，所述方法包括以下步驟：(a)準(zhǔn)備具有期望特性的皮膚 護(hù)理產(chǎn)品；(b)將所述皮膚護(hù)理產(chǎn)品施用于患者皮膚或皮膚等同物；（c)將皮膚或皮膚等同 物暴露于UVR ; (d)檢測經(jīng)暴露的患者皮膚或經(jīng)暴露的皮膚等同物的樣品中與UV暴露相關(guān) 聯(lián)的線粒體融合轉(zhuǎn)錄體的存在；和（e)將所述轉(zhuǎn)錄體的存在與參照值進(jìn)行比較。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了測試新的皮膚護(hù)理產(chǎn)品或制劑用于預(yù)防、減輕 或保護(hù)免受老化或光老化的功效的方法，所述方法包括以下步驟：(a)準(zhǔn)備具有期望特性 的皮膚護(hù)理產(chǎn)品；(b)將所述皮膚護(hù)理產(chǎn)品施用于患者皮膚或皮膚等同物；(C)將所述皮 膚或皮膚等同物暴露于UVR ;(d)檢測經(jīng)暴露的患者皮膚或經(jīng)暴露的皮膚等同物的樣品中 mtDNA缺失分子的存在，其中所述mtDNA缺失分子與UV暴露相關(guān)聯(lián)；和（e)將所述分子的 存在與參照值進(jìn)行比較。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了關(guān)于預(yù)防、減輕或保護(hù)免受皮膚老化或光老化 的能力篩選皮膚護(hù)理產(chǎn)品的方法，所述方法包括以下步驟：(a)將皮膚護(hù)理產(chǎn)品施用于患 者的皮膚或皮膚等同物；(b)將所述皮膚或皮膚等同物暴露于UVR ; (c)檢測與UV暴露相關(guān) 聯(lián)的線粒體融合轉(zhuǎn)錄體的存在；和（e)將對(duì)于每種經(jīng)測試的皮膚護(hù)理產(chǎn)品的融合轉(zhuǎn)錄體的 存在與參照值進(jìn)行比較和/或互相進(jìn)行比較。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了對(duì)于預(yù)防、減輕或保護(hù)免受老化或光老化的能 力來篩選皮膚護(hù)理產(chǎn)品的方法，所述方法包括以下步驟：(a)將皮膚護(hù)理產(chǎn)品施用于患者 的皮膚或皮膚等同物；(b)將所述皮膚或皮膚等同物暴露于UVR ; (c)檢測經(jīng)暴露的患者皮 膚或經(jīng)暴露的皮膚等同物的樣品中mtDNA缺失分子的存在，其中所述mtDNA缺失分子與UV 暴露相關(guān)聯(lián)；和（e)將對(duì)于每種經(jīng)測試的皮膚護(hù)理產(chǎn)品的缺失分子的存在與參照值進(jìn)行比 較和/或互相進(jìn)行比較。
【附圖說明】
[0032] 在參考附圖的以下詳細(xì)描述中，本發(fā)明的這些和其他特征將更加明顯。
[0033] 圖1示出了在去除核苷酸位點(diǎn)548-4442之后，來自位點(diǎn)386-547:4443-5511的框 架2的氨基酸序列。
[0034] 圖2示出了在去除核苷酸位點(diǎn)548-4442之后產(chǎn)生的閱讀框。核苷酸382由紅色 盒子指示，其識(shí)別關(guān)于線粒體基因組的位點(diǎn)1的閱讀框2的開始。
[0035] 圖3示出了通過去除核苷酸位點(diǎn)548-4442形成的框2融合轉(zhuǎn)錄體的起作用的序 列。
[0036] 圖4示出了通過核苷酸位點(diǎn)548-4442的缺失形成的融合轉(zhuǎn)錄體的最終氨基酸序 列。所述序列包括線粒體基因組的重組的核苷酸位點(diǎn)470-547和4443-5511。
[0037] 圖5A示出了使用mtDNA缺失分析的體內(nèi)UVR劑量應(yīng)答。
[0038] 圖5B示出了用于確定UV損傷的樣品計(jì)算。
[0039] 圖6至9示出了皮膚等同物中UV劑量之后本發(fā)明的融合轉(zhuǎn)錄體2、3、11、12、20和 32的表達(dá)。
[0040] 圖10至12示出了三種UV制劑的體內(nèi)和體外測試。
[0041] 圖13和14示出了 UV暴露之后對(duì)各種遮光劑和抗老化品牌的篩選。
[0042] 圖15示出了用于實(shí)施例3的日光模擬照射的UV光譜。
[0043] 圖16示出了用于實(shí)施例4的日光模擬照射的UV光譜。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 本發(fā)明提供了與UV暴露相關(guān)聯(lián)的新型線粒體融合轉(zhuǎn)錄體和相關(guān)的mtDNA分子。本 發(fā)明還提供了對(duì)生物樣品中融合轉(zhuǎn)錄體和相關(guān)的mtDNA分子的檢測和監(jiān)測。同樣地，本發(fā) 明提供了融合轉(zhuǎn)錄體和相關(guān)mtDNA缺失在篩選和測試皮膚護(hù)理產(chǎn)品中的用途。
[0045] 本發(fā)明的技術(shù)和程序一般來說根據(jù)本領(lǐng)域和各種通用參考書（見，例如Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laborato