Bk通道的特異性配體的重組質(zhì)粒及其重組表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種BK通道的特異性配體的重組質(zhì)粒的重組表達(dá)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在眾多離子通道中，鉀離子通道是分布最廣泛、亞型最多、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的一類離子 通道，幾乎存在大多數(shù)的生物中。鉀離子通道控制了廣泛的生物功能，其對于動作電位在可 興奮性細(xì)胞中的產(chǎn)生和傳播有著關(guān)鍵性作用，其激活和失活特性與動作電位的發(fā)放模式有 著密切關(guān)系。鉀離子通道的特異性配體在天然產(chǎn)物中的含量微乎其微，難以通過傳統(tǒng)的分 離純化手段獲得；且由于其分子量小的限制，通過常規(guī)體外表達(dá)方式，也難以獲得有活性的 多肽。
[0003] 目前，雖然已有超過10種短鏈毒素從東亞短鉗蝎（及ZiAw1S Karsch) 毒中被分離提取出來，然而無一被成功地體外表達(dá)，其中就包括BK通道的特異性配體 Martentoxin。Martentoxin (MarTX)是一種特異性作用于BK通道的短鏈肽毒素，由37個 氨基酸殘基構(gòu)成(分子量4060 Da)，隸屬于a-KTX 16亞家族，亦被稱為BmTX3B。因此，通過 體外表達(dá)途徑獲得天然產(chǎn)物中稀少的Martentoxin，對于充分地解析BK通道的受體位點， 及通道與配體相互作用的模式具有重要的推進(jìn)作用。但僅通過常規(guī)的體外表達(dá)方法獲得重 組Martentoxin (rMartentoxin)，其產(chǎn)量和活性均不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服技術(shù)中存在的缺陷，提供一種采用分子生物手段針對性地 修改體外表達(dá)載體PGEX-4T-3,并優(yōu)化體外表達(dá)方法，從而獲得重組的rMarTX的方法，該方 法具有良好的產(chǎn)量和毒素活性。
[0005] 本發(fā)明利用膜片鉗檢測了 rMarTX對4種鉀通道的藥理學(xué)效應(yīng)，其對4種鉀通道的 藥理學(xué)效應(yīng)和野生型幾乎吻合。
[0006] 曾有報告提示，重組毒素容易在諸如BL21及其衍生物BL21 (DE3)菌株等原核細(xì) 胞表達(dá)系統(tǒng)中形成包涵體，降低了其表達(dá)產(chǎn)物的活性和得率。在本研宄中，GST-rMarTX融 合蛋白始終溶于上清液中，并沒有形成包涵體。這或許是由于融合蛋白本身性質(zhì)與超聲破 菌的實驗條件決定的；冷凍干燥后對rMarTX的重折疊及HPLC的檢測也保證了毒素的結(jié)構(gòu) 準(zhǔn)確和得率。經(jīng)電生理記錄驗證，1 μ M的rMarTX可有效地抑制BK通道的電流，其IC5tl和 Hill系數(shù)與天然毒素十分相近。由此表明，經(jīng)BL2KDE3)系統(tǒng)表達(dá)具有生物活性的rMarTX 的途徑是可行的。
[0007] 為了提高毒素的產(chǎn)量，除了 PGEX-4T-3載體外，我們還嘗試了以下幾種異源表達(dá) 系統(tǒng)（pET32a和pGEX-KG)。遺憾的是，這些系統(tǒng)的產(chǎn)率不及pGEX-4T-3 (表1 )，最后被放棄 米用。
[0008] 表1各表達(dá)載體和大腸桿菌菌株rMarTX的得率
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種BK通道的特異性配體的重組表達(dá)方法，其特征在于該方法的具體步驟為： a. 基于MarTX的cDNA序列，涉及兩對引物，MarTX-正向引物為： 5'-1'1^66八1'(：0'176640^4了464-3'，其中包含一個83111!11的酶切位點 ；]\&11^乂-反向引物 為：5 ' -CTTCCCGGGTTAATCAGTAGCAT-3 '，其中包含一個Sma I的酶切位點；構(gòu)建載體質(zhì)粒 pGEX-4T-3_martentoxin ; b. 根據(jù)設(shè)計PCR點突變的引物序列： 其正向引物為：5' -GATGACGATGACAAGITTGGACTCATAGACGTAAAATGTITTG-3'，其中包含小 腸激酶識別位點的DNA序列； 反向引物是凝血酶酶切位點的DNA序列，該序列為：5' -GGATCCACGCGGAACCAGATC-3'， 其中包含一個BamH I位點；以該pGEX-4T-3-martentoxin質(zhì)粒為模板進(jìn)行反向PCR，所得 產(chǎn)物經(jīng)純化回收得該.DNA回收產(chǎn)物；該反向PCR的反應(yīng)體系為：pGEX-4T-3-martentoxin ?μL，正向引物 ?μL，反向引物 ?μL，2. 5mmol/L dNTPs 5μ1, IOXPCR buffer 5μ1, 25mmol/L MgCl2 2· 8μ1, 2· 5υ/μ1 KOD ?μL, ddH20 33. 2μ1 ; c. 將步驟b所得DNA純化回收并且將其回收產(chǎn)物磷酸化，并與Τ4連接酶連接； d. 將步驟c所得產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli/DH5a感受態(tài)細(xì)胞，得到了完整的表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-3-MarTX ； e. 將步驟d所得表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-MarTX轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株中，以誘導(dǎo)毒素蛋白 的表達(dá)，在冰浴下超聲破碎細(xì)胞，得裂解物； f. 將步驟e所得裂解物分離純化，超濾管脫鹽后，小腸激酶酶切并在室溫孵育20 h， 得酶切產(chǎn)物； g. 將步驟f所得酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后真空冷凍干燥，使用含有50 mM DTT的Tris-堿緩 沖液（pH 8.0)還原，得重組產(chǎn)物；該重組產(chǎn)物在包含I mM還原型谷胱甘肽（GSH)和0.1 mM 氧化型谷胱甘肽（GSSG)的0.05 M Tris-堿緩沖液（pH 8.0,其中有2 M鹽酸胍)中重折疊， 得到BK通道的特異性配體的重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0009] 該重組表達(dá)質(zhì)粒的序列為SEQ ID NO: 1所示的堿基序列。
[0010] 上述的步驟c中的DNA純化回收的具體步驟為： ① 柱平衡步驟：向吸附柱CA2中，（吸附柱放入收集管中）加入500 PL平衡液BL， 12,000 rpm離心一分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中； ② 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分）放入干凈的離心 管中，稱取重量； ③ 向膠塊中加入溶膠液PN:如凝膠重為O.lg，溶膠液為100 μL，依此類推；50°C水浴 放置10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解； ④ 將上一步所得溶液加入一個吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中)，室溫放置2分 鐘，12, 000 rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中； ⑤ 向吸附柱CA2中加入700 μL漂洗液PW，12, 000 rpm離心60秒，倒掉收集管中 的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中； ⑥ 向吸附柱CA2中加入500 μL漂洗液PW，12, 000 rpm離心60秒，倒掉廢液； ⑦ 將吸附柱CA2放回收集管中，12, 000 rpm離心2分鐘，盡量除盡漂洗液。將吸附 柱CA2開蓋至于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗； ⑧ 將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量洗脫緩沖 液EB，洗脫緩沖液EB應(yīng)置于65-70° C水浴預(yù)熱，室溫放置2分鐘；12, 000 rpm離心2 分鐘收集DNA溶液。
[0011] 上述的步驟d的轉(zhuǎn)化E.coli/DH5a感受態(tài)細(xì)胞，得到了完整的表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-3_MarTX的具體步驟為：10 PL連接產(chǎn)物與100 PL的感受態(tài)細(xì)胞溫和混勻，插入 冰中放置30分鐘；42°C熱擊90秒，然后快速插入冰中3分鐘；加入400 μL的不含氨 芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基，180 rpm，37°C培養(yǎng)45分鐘；吸取100 PL涂板，37°C正置15 分鐘，待完全吸收后，倒置培養(yǎng)14-16小時。挑取單菌落，接種于3 mL含有氨芐青霉素 (100 Pg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖16~18 h;利用普通質(zhì)粒小提試劑盒小量抽提質(zhì) 粒，陽性重組子送測序；從而得到了完整的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3-MarTX。
[0012] 上述的步驟e的具體方法為：將步驟b所述的表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-3_MarTX被轉(zhuǎn)化 至大腸桿菌菌株BL21 (DE3)中，菌株細(xì)胞在含有0.1 mg/mL氨節(jié)青霉素的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基(體積為I L)中生長，培養(yǎng)溫度為37°C ;當(dāng)菌液0_值達(dá)到0· 4-0. 6時，加入 終濃度為0.5 mM的Isopropyl-|3-d-thiogalactoside (IPTG)以誘導(dǎo)毒素蛋白的表達(dá)，大 腸桿菌細(xì)胞在28°C持續(xù)生長4小時；以5000 g轉(zhuǎn)速離心10 min以收集細(xì)胞，重懸于70 mL 的 IX 磷酸鹽緩沖液（PBS，137mMNaCl, 4.3mMNa2HP04, 2.7mMKCl, L4mMKH2P04， pH 7. 4);冰浴并超聲破碎細(xì)胞（4 bursts/min)，持續(xù)20 min，得裂解物。
[0013] 上述的步驟f的具體步驟為：將步驟e所得裂解物在4 °C下，以12, 000 g的轉(zhuǎn) 速離心15 min，上清液使用0. 45的濾膜過濾，通過含有谷胱甘肽-瓊脂糖4B填料顆粒的 Econo-層析柱親和層析，流速控制在0.03 mL/min;由事先預(yù)冷的30 mL PBS緩沖液洗脫， 流速為〇. 3 mL/min ;GST-rMarTX融合蛋白用10 mM谷胱甘肽洗脫緩沖液從親和柱填料上洗 脫；GST-rMarTX通過截留分子量為10 kDa超濾管脫鹽，加入10 U/mL的小腸激酶酶切并在 室溫孵育20 h，得酶切產(chǎn)物。
[0014] 在構(gòu)建載體質(zhì)粒pGEX-4T-3_martentoxin的表達(dá)系統(tǒng)中，6個多余的堿基對出現(xiàn) 在凝血酶酶切位點和MarTX的cDNA序列之間。這將會導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物GST-rMarTX被凝血酶 酶切后rMarTX的N端出現(xiàn)多余的2個氨基酸殘基。在本專利的重組表達(dá)方法中，通過創(chuàng)新 性地引入小腸激酶酶切位點，致使N端兩個額外的氨基酸被移除，其結(jié)果易化了 rMarTX對 BK通道的阻斷效應(yīng)。其特征步驟為：通過使用KOD突變試劑盒所描述的點突變方法可將 多余的堿基對去除。PCR點突奪的ιΗ向引物為（5'-GATGACGATGACAAGTTTGGACTCATAGACGTAA AATGTTTTG-3'）包含小腸激酶識別位點的DNA序列（下劃線)，反向引物是凝血酶酶切位點的 DNA序列（5' -GGATCCACGCGGAACCAGATC-3' )，其中包含一個BamH I位點（下劃線)。從而使 得本發(fā)明的質(zhì)粒在分子改造過的PGEX-4T-3系統(tǒng)中被成功表達(dá)，之后的功能鑒定其分子量 和生物活性與天然MarTX幾乎吻合。
[0015] 目前，超過10種短鏈毒素從東亞短鉗蝎毒中被分離提取出來，然而無一被成功地 體外表達(dá)，其中就包括BK通道的特異性配體Martentoxin。僅通過常規(guī)的體外表達(dá)方法獲 得重組Martentoxin (rMartentoxin)，其產(chǎn)量和活性均不高。本發(fā)明通過針對性地修改體 外表達(dá)載體PGEX-4T-3,優(yōu)化常規(guī)的體外表達(dá)方法，從而獲得重組的rMarTX，該方法所得產(chǎn) 物具有良好的產(chǎn)量和毒素活性。
【附圖說明】
[0016] 圖1為pGEX-4T-3-rMarT