一種切除篩選標簽的方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種切除篩選標簽的方法與應用，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 土曲霉是一種重要的絲狀真菌，能夠產生多種有價值的化合物，包括有機酸、酶 類、脂類以及具有生物活性的次級代謝產物。其中衣康酸和洛伐他汀已經實現(xiàn)工業(yè)化生產， 具有很大的市場。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，通過代謝工程對生產菌株進行改造，提高目 標產物的生產水平，具有非常重要的意義。
[0003] 隨著分子生物學技術的不斷進步，功能基因組學以及菌株的基因工程改造變得越 來越重要。近年來，大量組學數(shù)據的不斷公布，功能基因組學研宄以及基因工程改造往往涉 及到多基因、多位點，而且還會用到多種研宄策略。而篩選標簽是遺傳操作過程中所需要的 一種重要元件，外源DNA需要與篩選標簽一起整合到基因組上，然后再通過篩選標簽的表 型被篩選出來。而在土曲霉中可用的篩選標簽非常少，無法滿足對多基因、多位點進行遺傳 改造的需求。位點特異性重組系統(tǒng)是一種重要的分子遺傳操作工具，其原理是重組酶識別 并結合到具有特殊DNA序列的靶位點上，催化重組反應，使得位于靶位點之間的DNA片段被 剔除。基于此，在被成功應用于篩選標簽的切除。常用的位點特異性重組系統(tǒng)有Cre/loxP 系統(tǒng)、β -rec/six系統(tǒng)和Flp/FRT系統(tǒng)，但在傳統(tǒng)應用過程中需要以穿梭質粒形式或基因 組整合形式向細胞中導入重組酶表達元件，通過誘導等方式在細胞內表達出重組酶，并作 用于識別位點對篩選標簽進行切除。pyrG(乳清苷-5-磷酸脫羧酶基因）是一種與尿嘧啶 營養(yǎng)缺陷性菌株搭配使用的營養(yǎng)選擇型標簽，基于PyrG作為篩選標簽的轉化系統(tǒng)具有雙 向篩選功能的特征，篩選標簽存在與否都可以通過相應的篩選培養(yǎng)基進行篩選。因此搭配 位點特異性重組系統(tǒng)使用，會使得篩選標簽的剔除更加高效、易行。

【發(fā)明內容】

[0004] 為解決土曲霉遺傳操作過程中可用篩選標簽數(shù)量有限，導致基因打靶技術在土曲 霉遺傳改造領域中應用受到限制的技術問題，本發(fā)明提供了一種切除篩選標簽的方法，使 篩選標簽可循環(huán)利用，遺傳改造不再受篩選標簽不足所限制，所采取的技術方案如下：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種切除篩選標簽的方法，該方法是以染色體上整合了 PyrG篩選標簽的重組菌為出發(fā)菌，利用位點特異性重組系統(tǒng)切除pyrG篩選標簽使菌株能 再次作為出發(fā)菌使用PyrG篩選標簽進行遺傳轉化。
[0006] 優(yōu)選地，所述出發(fā)菌，為土曲霉（Aspergillus terreus)。
[0007] 更優(yōu)選地，所述出發(fā)菌，為敲除了 ku80基因或lig4基因的土曲霉。
[0008] 優(yōu)選地，所述染色體上整合了 pyrG篩選標簽的重組菌，pyrG篩選標簽的兩側帶有 同向的IoxP序列。
[0009] 優(yōu)選地，所述pyrG篩選標簽源于曲霉，更優(yōu)選地，來源于黑曲霉。
[0010] 優(yōu)選地，所述位點特異性重組系統(tǒng)，為Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)；所述切除 PyrG篩選標簽，是切除兩側帶有同向IoxP序列的篩選標簽pyrG。
[0011] 優(yōu)選地，所述Cre/loxP位點特異性重組系統(tǒng)，Cre重組酶的用量為2-9U。
[0012] 所述方法的步驟如下：
[0013] 1)以pyrG基因缺失的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型土曲霉為受體菌，以源于黑曲霉的兩端 帶有同向IoxP位點的PyrG基因表達元件loxP-pyrGl-loxP作為篩選標簽進行回補實驗， 獲得整合有ΙοχΡ-pyrGl-loxP篩選標簽的重組菌；
[0014] 2)制備步驟1)中所述重組菌的原生質體，以DNA為輔助載體向原生質體細胞 中導入2-9U的Cre重組酶進行篩選標簽切除，通過篩選尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型的方式篩選 loxP-pyrGl-loxP篩選標記被切除的重組菌。
[0015] 優(yōu)選地，所述方法的具體步驟如下：
[0016] 1)分別敲除土曲霉CICC 40205的ku80基因和pyrG基因，構建尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型 重組菌 At- Δ ku80_ Δ pyrG ;
[0017] 2)以黑曲霉Co827的pyrG基因表達元件pyrGl為篩選標簽，通過分子克隆 的方式在兩側加上同向的IoxP序列，獲得兩端帶有同向IoxP位點的PyrG篩選標記 loxP-pyrGl-loxP，以步驟1)所構建的尿喃啶營養(yǎng)缺陷型重組菌At- Δ ku8〇- Δ pyrG為受體 菌，以loxP-pyrGl-loxP為篩選標簽進行回補實驗，獲得整合有l(wèi)oxP-pyrGl-loxP篩選標簽 的重組菌 At- Δ ku8〇-pyrGl_loxP ;
[0018] 3)制備步驟2)所得重組菌At-Aku80-pyrGl-loxP的原生質體，以DNA為輔助載 體向原生質體細胞中導入2-9U的Cre重組酶進行篩選標簽切除，通過篩選尿嘧啶營養(yǎng)缺陷 型的方式篩選loxP-pyrGl-loxP篩選標記被切除的重組菌。
[0019] 所述任一方法用于制備不受篩選標簽數(shù)量限制可重復進行遺傳轉化操作的重組 菌。
[0020] 利用所述任一方法制備獲得的重組菌也在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0021] 優(yōu)選地，所述方法的具體步驟如下：
[0022] 1)以土曲霉CICC40205的基因組為模板，以如SEQ ID NO. 12-SEQ ID NO. 13所示 核苷酸序列為引物，擴增pyrG基因的上游序列U-pyrG ;再以土曲霉CICC40205的基因組為 模板，以如SEQ ID NO. 14-SEQ ID NO. 15所示核苷酸序列為引物，擴增pyrG基因的下游序 列D-pyrG ;再利用融合PCR融合上游序列U-pyrG和下游序列D-pyrG，以融合產物的序列 為模板，以如SEQ ID NO. 16-SEQ ID NO. 17所示核苷酸序列為引物，通過PCR擴增出pyrG 基因的打祀元件pyrG-ΚΟ,再制備步驟1)所得重組菌At-Aku80的原生質體，再將pyrG基 因的打革G元件pyrG-KO轉化到原生質體內，經培養(yǎng)篩選后獲得pyrG基因被敲除的尿喃啶營 養(yǎng)缺陷型菌株At- Δ ku80_ Δ pyrG ;
[0023] 2)通過人工合成帶有兩個同向IoxP序列位點的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，再將該DNA片段克隆到載體pUC57simple上，獲得載體PalcA-syn ;以黑曲霉 Co827基因組為模板，以如SEQ ID NO. 18-SEQ ID NO. 19所示核苷酸序列為引物，通過PCR 擴增出黑曲霉pyrG基因的表達元件，作為篩選標簽pyrGl，再將篩選標簽pyrGl克隆到載 體PalcA-syn上，獲得質粒pXH103,獲得如SEQ ID NO. 26所示的兩側帶有同向IoxP位點 序列的 PyrGl 篩選標簽 loxP-pyrG-loxP ;再以 pSGF957 為模板，以如 SEQ ID NO. 20-SEQ ID NO. 21所示核苷酸序列為引物，通過PCR擴增出NDA片段gfp-TtrpC片段，再將gfp-TtrpC 片段連接到質粒PXH103上，獲得質粒pXH104 ;再以土曲霉CICC40205基因組為模板，以如 SEQ ID NO. 22-SEQ ID NO. 23所示核苷酸序列為引物，通過PCR擴增出ku80基因下游同源 臂片段，再將擴增的出ku80基因下游同源臂片段連接到質粒pXH104上，獲得質粒pXH105 ; 再以土曲霉CICC40205基因組為模板，以如SEQ ID NO. 24-SEQ ID NO. 25所示核苷酸序 列為引物，通過PCR擴增出ku80基因上游同源臂片段，再將擴增的出ku80基因上游同源 臂片段連接到質粒PXH105上，獲得質粒pXH106 ;最后再以質粒pXH106為模板，以SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 10所示序列為引物擴增出打靶元件ku80-pyrGl-gfp ;再將打靶元件 ku80-pyrGl-gfp轉化入步驟2)所得的尿喃啶營養(yǎng)缺陷型菌株At- Δ ku80- Δ pyrG中，經過 培養(yǎng)篩選后獲得帶有1〇1?15^61-1(??的重組菌41：-八1〇18〇15^61-1(??;從而證明成功建 立了基于尿嘧啶營養(yǎng)缺陷重組菌和PyrG基因作為篩選標簽的遺傳轉化系統(tǒng)。
[0024] 3)制備步驟3)所得重組菌At-Aku8〇-pyrGl_loxP的原生質體，向已制備好的 100 μ L濃度為IO8個/mL的原生質體溶液中加入2U Cre重組酶、1 μ g pyrGl片段和10 μ L 40%的PEG4000,混合均勻后冰浴30min，加入1ml PSTC溶液后于30°C下孵育30min，孵育 結束后與含有I. 2M山梨醇，4g/L瓊脂糖和2mM尿嘧啶核苷的頂層瓊脂培養(yǎng)基混合后傾注 于含有I. 2M山梨醇，lg/L 5-氟乳清酸和IOmM尿嘧啶核苷的⑶再生篩選培養(yǎng)基平板中， 在30°C，黑暗條件下培養(yǎng)6-10d，培養(yǎng)結束后挑取轉化子接種到⑶FU平板上于32°C下培養(yǎng) 5-7天進行傳代純化，傳代純化3-5次后，獲得pyrGl篩選標簽被切除的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型 重組菌At-Λ ku80_ Λ pyrGl-loxP ;從而實現(xiàn)篩選標簽的循環(huán)利用，突破遺傳改造受篩選標 簽數(shù)量的限制，可以再次進行基于PyrGl篩選標簽的遺傳轉化