利用質(zhì)譜進行葉酸遺傳代謝能力檢測的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于確定葉酸遺傳代謝能力相關(guān)基因多態(tài)性 位點（SNP)的檢測方法及產(chǎn)品，具體而言是利用多重PCR技術(shù)、單堿基延伸技術(shù)和質(zhì)譜技 術(shù)，葉酸遺傳代謝能力的3個基因多態(tài)位點進行檢測的方法及相應(yīng)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉酸是B族維生素的一種，參與DNA、RNA、蛋白質(zhì)等其他重要化合物的合成，在機 體代謝過程中發(fā)揮重要的作用，常用于孕期營養(yǎng)補充，從而預(yù)防神經(jīng)管缺陷等疾病。
[0003] 我國患出生缺陷排在前5位的包括：先天性心臟病，神經(jīng)管畸形，唇腭裂，唐氏綜 合癥，多指（趾）。根據(jù)2003年的統(tǒng)計結(jié)果，我國先天性心臟病的發(fā)病人數(shù)達到11-16萬 人。根據(jù)2004年的統(tǒng)計結(jié)果，我國神經(jīng)管畸形的發(fā)病發(fā)生率為9. 44/萬。此外，根據(jù)2003 年的統(tǒng)計結(jié)果，唐氏綜合癥的發(fā)病率位18000人，
[0004] 神經(jīng)管畸形是指由于胚胎在母體內(nèi)發(fā)育至第3-4周時，神經(jīng)管未能閉合所造成的 先天缺陷，可導(dǎo)致脊柱裂，腦膨出和無腦畸形。
[0005] 先天性心臟病是器官形成期心血管系統(tǒng)發(fā)育導(dǎo)致的一種疾病。研宄表明，HCY可 影響胚胎早期心血管發(fā)育，補充葉酸能夠明顯緩解同型半胱氨酸對心血管的發(fā)育毒性，降 低CHD的發(fā)病風(fēng)險。
[0006] 有研宄認(rèn)為，由于葉酸代謝相關(guān)基因的缺陷致葉酸的代謝障礙引起的甲基化導(dǎo) 致染色體不分離，可能是發(fā)生唐氏綜合征的危險因素。
[0007] 葉酸缺乏引起HCY，從而引起唇腭裂，包括唇裂（俗稱：兔唇）和腭裂（俗稱：狼 咽）。這種疾病與參與葉酸代謝的基因有很大關(guān)系，如果一個嬰兒的哥哥或姐姐也有這種先 天缺陷，那這個嬰兒便比其他嬰兒多30至40倍的可能出現(xiàn)這種缺陷。
[0008] 高同型半胱氨酸血癥與妊高征關(guān)系密切，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷，并可能是妊 高征的發(fā)病因素之一。Hcy的輕中度升高可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞的抗凝功能下降，可以使內(nèi)皮細 胞合成減少，影響前列環(huán)素（PGI2)的合成，而PGI2有抑制血小板的粘附和聚集，增強血 管擴張的作用。
[0009] 孕婦體內(nèi)葉酸缺乏是造成早產(chǎn)或流產(chǎn)的重要原因之一。葉酸缺乏引起的流產(chǎn)或早 產(chǎn)，采用其它任何補救措施都難以避免。
[0010] 大量的科學(xué)研宄表明，葉酸攝入絕對或相對的缺乏，是引起高同型半胱氨酸血癥 的直接原因。引起葉酸缺乏的主要原因，遺傳因素：機體葉酸利用能力的先天性不足，引起 葉酸缺乏；攝入不足：膳食中葉酸不足或烹調(diào)加工損失；需要量增加：孕婦、乳母都處于特 殊的生理狀態(tài)，葉酸需要量增加，造成相對不足；其它不良因素：酗酒、服用某些藥物（如抗 驚厥類藥物）等均可導(dǎo)致葉酸的缺乏。
[0011] 亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR)是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，催化5, 10-亞甲基四氫葉 酸還原為5-甲基四氫葉酸。人類MTHFR基因位于染色體1ρ36. 3,其中有多個與MTHFR活性 相關(guān)的 SNP 位點，例如 G1965A、A1515C、C894T、以及 677C 和 1298A 等。
[0012] MTHFR第1298位堿基A>C突變（rsl801131)，導(dǎo)致谷氨酰胺被丙氨酸取代，產(chǎn)生產(chǎn) 生了三種基因型：野生型（A/A)，雜合突變型（A/C)和純合突變型（C/C)，引起MTHFR活性 下降，高半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸的能力下降，導(dǎo)致血漿中半胱氨酸（Hcy)升高。其中野生 型，雜合突變型和純合突變型三種基因型在中國人群中分布所占比例為66. 8%，29. 3%和 3. 9%〇
[0013] MTHFR第677位堿基OT突變（rsl801133)，導(dǎo)致編碼MTHFR蛋白葉酸結(jié)合區(qū)域 222位的丙氨酸被纈氨酸取代，產(chǎn)生了三種基因型：野生型（C/C)，雜合突變型（C/T)和純合 突變型（T/T)，導(dǎo)致MTHFR酶活性降低，同型半胱氨酸在體內(nèi)積累。其中野生型，雜合突變型 和純合突變型三種基因型在中國人群中分布所占比例為33%，44%和23%。
[0014] 甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR)能夠通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活 性的甲硫氨酸合酶，是葉酸代謝的關(guān)鍵酶之一。主要突變型有十余種，其中A2756G在西 方人群中較為常見，另外還有122M(A66G)、S175L、其它一些片段插入缺失和點突變，其中 A66G是最主要和研宄最多的突變。
[0015] MTRR基因第66位堿基A>G突變（rsl801394)，在氨基酸鏈殘基22處蛋氨酸被異亮 氨酸替代，可引起MTRR酶的活性降低，易導(dǎo)致同型半胱氨酸血癥、神經(jīng)管缺陷等疾病。上述 基因位點變異，會顯著影響機體的葉酸利用能力，進而引起孕婦發(fā)病風(fēng)險和嬰兒出生缺陷。 其中野生型（A/A)，雜合突變型（A/G)和純合突變型（G/G)三種基因型在中國人群中分布所 占比例為58%，36%和6%。
[0016] 機體葉酸利用能力的先天性不足，引起葉酸缺乏時，需要對補充適當(dāng)?shù)娜~酸，以維 持機體機內(nèi)正常的生物代謝。我國推薦孕期補充量為400微克/天，可以將顯著降低患兒 的出生缺陷，如能夠降低NTDs(41% -85% )，但是還有15% -59%卻效果不明顯，通過增加 合適劑量的葉酸可以進一步降低NTDs。個性化補充葉酸，即讓補充葉酸更具有針對性。專 家建議：根據(jù)自己的遺傳體質(zhì)，在正確的時間補充合適劑量的葉酸。
[0017] 對MTHFR基因、MTRR基因及其相關(guān)位點的檢測，可以直接發(fā)現(xiàn)被檢測者葉酸代謝 方面的遺傳缺陷（即葉酸的利用能力），從而根據(jù)風(fēng)險高低（相關(guān)代謝酶的活性程度）。如 由發(fā)明人和中國疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心聯(lián)合組織的孕期葉酸利用能力檢測所提 供的增補參考量：
[0018] 表1 :孕期葉酸利用能力檢測所提供的增補參考量表
[0020] 以上補充劑量指合成葉酸補充劑或強化劑的攝入量，不包括食物；對所有成年人 包括孕婦和乳母，合成葉酸制劑的可耐受的最高攝入量（UL)設(shè)定為1000微克/天。因此 800微克/天的葉酸制劑是安全的。
[0021] 對葉酸的增補劑量并非越多越好。大量研宄發(fā)現(xiàn)，過量補充葉酸會導(dǎo)致以下不良 后果：導(dǎo)致體內(nèi)鋅缺乏。鋅是多種酶的活化劑，因此，孕母過量補充會導(dǎo)致胎兒生長緩慢，出 生體重過低。
[0022] 利用現(xiàn)代基因分型技術(shù)（熒光PCR，Sanger測序等）檢測孕婦的葉酸代謝相關(guān)基 因，根據(jù)基因分型結(jié)果對受檢者葉酸利用能力進行分級，進而針對性的調(diào)整葉酸補充劑量。 目前常用的檢測技術(shù)中，測序需對多個位點逐一進行檢測，操作復(fù)雜，費用較高。芯片法雖 可檢測多個位點，但操作過程繁瑣，檢測費用高。
[0023] 中國實用新型專利ZL 201420084983和發(fā)明專利ZL201410067910、名稱"單管聯(lián) 合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒及檢測方法"公 開一種利用多重PCR技術(shù)檢測亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的方法，該方法能夠準(zhǔn) 確測定MTHFR的C677T突變位點，從而有利于預(yù)測個體對葉酸的代謝能力，指導(dǎo)孕產(chǎn)婦和兒 童補充適合劑量的葉酸補充劑等。但該技術(shù)只能檢測單一突變位點，且仍然存在傳統(tǒng)PCR 擴增檢測技術(shù)的缺陷。
[0024] 在應(yīng)用檢測MTHFR基因和/或MTRR基因的突變位點的新技術(shù)來中，質(zhì)譜技術(shù)顯示 出其準(zhǔn)確、高效的優(yōu)勢。其中，張孝平等（胰腺癌細胞DPYD、MTHFR基因單核苷酸多態(tài)性分 析，《山東醫(yī)藥》2011年第45期；胃癌細胞DPYD、MTHFR基因單核苷酸多態(tài)性的檢測，《江蘇 醫(yī)藥》2011年第17期）和陳寶安等（應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)檢測結(jié)腸癌DPYD、MTHFR基因單核苷酸 多態(tài)性，《癌變?畸變?突變》第24卷第2期）公開了利用MALDI-T0F質(zhì)譜技術(shù)檢測MTHFR 基因的三個 SNPs 位點 G1965A(rs2274976)、A1515C(rsl801131)及 C894T(rsl801133)，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)該位點突變可能導(dǎo)致MTHFR活性改變，影響氟尿嘧啶類藥物的體內(nèi)代謝，且與氟尿 嘧啶類藥物的療效及毒副反應(yīng)相關(guān)。然而，以上技術(shù)均是聯(lián)合檢測DPYD基因（二氫嘧啶脫 氫酶基因）和MTHFR基因的突變，通過預(yù)測臨床預(yù)測氟嘧啶類藥物的療效及毒副反應(yīng)，使腫 瘤患者在選用最佳藥物方案、劑量及最大限度地降低藥物毒副反應(yīng)方面受益。因此，研宄人 員根據(jù)上述技術(shù)的教導(dǎo)，易于想到通過質(zhì)譜技術(shù)檢測MTHFR的上述三個位點來確定腫瘤患 者的最佳用藥方案，而難以想到對該三個位點進行調(diào)整改變，以及難以想到用于指導(dǎo)葉酸 服用人群進行合理攝入葉酸的用途。
[0025] 綜合所述，目前存在的技術(shù)問題是：缺乏一次能同時檢測多個葉酸相關(guān)的基因多 態(tài)位點的方法和產(chǎn)品，常見的檢測技術(shù)，如測序、實時熒光定量PCR等，均需對位點逐一進 行檢測，當(dāng)位點較多時操