檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及菌種的PCR檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的熒 光定量PCR引物對(duì)和探針，本發(fā)明還涉及利用該引物對(duì)和探針進(jìn)行肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)的 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎克雷伯氏菌屬于革蘭氏陰性菌，桿狀，有大量黏性的多糖形成的莢膜包覆。肺 炎克雷伯氏菌為呼吸道感染的重要病原體，常引起重癥肺炎，還可引起泌尿道感染、膽道感 染、敗血癥和化膿性腦膜炎等嚴(yán)重疾病。感染多發(fā)生于住院的衰弱患者。病原體往往從上 呼吸道吸入，或通過(guò)污染的人工呼吸器、霧化器或各種導(dǎo)管侵入人體。肺炎克雷伯氏菌已成 為醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌之一，在某些國(guó)家中占院內(nèi)感染的首位。因此，臨床上迫切需要 一種快速、準(zhǔn)確的體外檢測(cè)手段辨識(shí)菌種類(lèi)型，進(jìn)行有針對(duì)性的個(gè)體化治療。
[0003] 傳統(tǒng)的細(xì)菌檢驗(yàn)方法主要通過(guò)涂片鏡檢和分離培養(yǎng)的方法對(duì)細(xì)菌生理化特征進(jìn) 行分類(lèi)。涂片鏡檢的方法需要有豐富經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)工作者根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、排列方式和染色性 作出初步診斷，分離培養(yǎng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能進(jìn)行結(jié)果判讀，不利于及時(shí)診斷病原?；颊哂?病情惡化蔓延的風(fēng)險(xiǎn)。熒光定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量，而且具有靈 敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、穩(wěn)定性好、無(wú)污染、實(shí)時(shí)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)， 目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研宄和醫(yī)學(xué)研宄等領(lǐng)域。而傳統(tǒng)的肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)方法 具有耗時(shí)長(zhǎng)、檢出率低、準(zhǔn)確性低和重復(fù)性差的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的試劑盒。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道的肺炎克雷伯氏菌phoE基因序列 比對(duì)，通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行序列同源性分析，找到特異性的保守靶序列，發(fā)現(xiàn)了核苷酸完全 保守區(qū)域，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，該靶序列是檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的遺傳標(biāo)記 物。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該序列的特異性片段也可以作為檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌 的遺傳標(biāo)記物。
[0006] 進(jìn)一步，本發(fā)明還提供用于特異性擴(kuò)增上述靶序列的引物，以及與所述引物配合 使用的焚光探針。可以使用諸如Primer Express Version 3等軟件來(lái)設(shè)計(jì)探針和引物。通 常引物長(zhǎng)度為15-30個(gè)堿基，一條引物序列與本發(fā)明提供的遺傳標(biāo)記物序列相同，另一條 引物序列與該遺傳標(biāo)記物序列互補(bǔ)；通常Taqman探針長(zhǎng)度為20-50個(gè)堿基，其序列與上述 遺傳標(biāo)記物相同或互補(bǔ)，其5'標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ-I。
[0007] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選的引物序列為：
[0008] 上游引物：5 ' -GATGGGCTTTGTGGCTTCAA-3 '
[0009] 下游引物：5 ' -CCAGCTTGTTCGCGTTCTTAT-3 '。
[0010] 探針序列為：
[0011] (FAM) 5 ' -AGCGACGCAGGCAGCGGAA-3 '（BHQl)。
[0012] 本發(fā)明提供了上述特異性引物對(duì)和熒光探針在制備檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌試劑盒 中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明提供一種肺炎克雷伯氏菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，包括以樣品總 DNA為模板，以上述遺傳標(biāo)記物為靶序列，利用本發(fā)明提供的引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR，同時(shí)設(shè)立無(wú)模板對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
[0014] 本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，當(dāng)為20 μ 1反應(yīng)體系時(shí)，其優(yōu)選配置 為：
[0015]
[0016]
[0017] 本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95°C、5min ;再經(jīng)95°C變性 15s，60°C退火60s，35個(gè)循環(huán)。
[0018] 本發(fā)明每次檢測(cè)標(biāo)本時(shí)必須設(shè)立NTC對(duì)照（無(wú)模板對(duì)照）和POS對(duì)照（陽(yáng)性對(duì) 照），兩種對(duì)照對(duì)于結(jié)果判讀起決定性作用：
[0019] 有效擴(kuò)增：NTC ( -）和 POS (+)
[0020] 無(wú)效擴(kuò)增：NTC (+)和POS (+)提示體系污染
[0021] 無(wú)效擴(kuò)增：NTC( -）和POS ( -）提示體系錯(cuò)誤或者試劑失效。
[0022] 在對(duì)照有效擴(kuò)增的情況下，樣品檢測(cè)結(jié)果可信，否則試驗(yàn)需要重復(fù)；在檢測(cè)中兩種 對(duì)照為有效擴(kuò)增時(shí)，樣本結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0023] Ct值小于等于28的標(biāo)本為陽(yáng)性結(jié)果；
[0024] Ct值大于35的標(biāo)本為陰性結(jié)果；
[0025] Ct值在28-35之間的標(biāo)本需要重復(fù)，重復(fù)試驗(yàn)如Ct值依然低于28判定為陽(yáng)性擴(kuò) 增，超過(guò)28判定為陰性擴(kuò)增。
[0026] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的試劑盒，其包括上述特異性引物以及配 合引物對(duì)使用的Taqman探針。
[0027] 本發(fā)明試劑盒含有的特異性引物對(duì)和熒光探針的序列為：
[0028] 上游引物：5 ' -GATGGGCTTTGTGGCTTCAA-3 '
[0029] 下游引物：5 ' -CCAGCTTGTTCGCGTTCTTAT-3 '。
[0030] 探針序列為：
[0031] (FAM) 5'-AGCGACGCAGGCAGCGGAA-3'（BHQl)。
[0032] 本發(fā)明提供的試劑盒，還包括熒光定量反應(yīng)液，陰性模板和陽(yáng)性模板，所述陰性模 板為去核酸水，所述陽(yáng)性模板為肺炎克雷伯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。
[0033] 本發(fā)明提供了用于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的phoE基因保守區(qū)域靶序列，以及以該 序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的引物和探針，具有較強(qiáng)的特異性，利用該引物和探針進(jìn)行肺炎克雷伯氏 菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法進(jìn)一步簡(jiǎn)化肺炎克雷伯氏菌的檢測(cè)的程序、縮短檢測(cè)周期，用 于檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌株，可作為檢測(cè)臨床標(biāo)本的手段，提高肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)的陽(yáng)性 率。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒，其反應(yīng)體系包含了上述引物、探針和陰性陽(yáng)性對(duì)照，該試劑 盒的推廣應(yīng)用有利于快速、準(zhǔn)確地鑒定肺炎克雷伯氏菌。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1為本發(fā)明實(shí)施案例1中的肺炎克雷伯氏菌不同引物探針組合的熒光擴(kuò)增曲 線，橫坐標(biāo)為閾值循環(huán)數(shù)Ct值，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光值，其中1代表引物探針組合（1)，2代表 引物探針組合（2)，3代表引物探針組合（3)，4代表三種反應(yīng)體系的陰性對(duì)照。
[0035] 圖2為本發(fā)明實(shí)施案例2中的的肺炎克雷伯氏菌的特異性檢測(cè)熒光擴(kuò)增曲線，橫 坐標(biāo)為閾值循環(huán)數(shù)Ct值，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光值，其中1代表肺炎克雷伯氏菌，2代表屎腸球 菌、糞腸球菌、金黃色葡糖球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌、溶血 葡萄球菌和陰性對(duì)照。
[0036] 圖3為本發(fā)明實(shí)施案例3中的的肺炎克雷伯氏菌的靈敏度檢測(cè)熒光擴(kuò)增曲線，橫 坐標(biāo)為閾值循環(huán)數(shù)Ct值，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光值，其中1代表1 X IO6CFUAiI菌液的模板，2代 表1 X 105CFU/ml菌液的模板，3代表1 X 104CFU/ml菌液的模板，4代表1 X 103CFU/ml菌液 的模板，5代表1 X 102CFU/ml菌液的模板，6代表陰性對(duì)照。
[0037] 圖4為熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為初始模板濃度的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為閾值循環(huán) 數(shù)，Ct = -3. 5081gXQ+34. 933,其中Ct為閾值循環(huán)數(shù)，X。為初始模板濃度（拷貝/ml)，R2 = 0.9947。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0039] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0040] 實(shí)施例1熒光定量PCR檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌的方法的建立
[0041] 1、引物和探針設(shè)計(jì)
[0042] 針對(duì)肺炎克雷伯氏菌的PhoE基因保守區(qū)域，本實(shí)施例設(shè)計(jì)了 3對(duì)引物及與其配合 使用的探針，3對(duì)引物均位于phoE基因上，其核苷酸序列如下：
[0043] (1)
[0044] 上游引物：5 ' -GATGGGCTTTGTGGCTTCAA-3 '
[0045] 下游引物：5 '-CCAGCTTGTTCGCGTTCTTAT-3'
[0046] 探針：5 '-AGCGACGCAGGCAGCGGAA-3'
[0047] (2)
[0048] 上游引物：5 ' -CGAT