用于修飾的核苷酸的氧化劑的制作方法
【專利說(shuō)明】用于修飾的核苷酸的氧化劑
[0001] 本發(fā)明涉及尤其是氧化劑的試劑，用于檢測(cè)修飾的胞嘧啶殘基、以及分析和/或 測(cè)序包含修飾的胞嘧啶殘基的核酸。
[0002] 5-甲基胞嘧啶（5mC)是充分研宄的、在基因沉默和基因組穩(wěn)定性中起重要作用 的表觀遺傳 DNA標(biāo)記，并發(fā)現(xiàn)其富集于CpG二核苷酸中（1)。在后生動(dòng)物中，5mC可通過(guò) 10-11易位（TET)家族的酶被氧化成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC) (2, 3)。5hmC的整體水平大 概比5mC的整體水平低10倍，并在組織之間變化（4)。相對(duì)高數(shù)量的5hmC(所有胞嘧啶~ 0. 4% )存在于胚胎干（ES)細(xì)胞中，其中5hmC被認(rèn)為在建立和/或維護(hù)多能性中發(fā)揮作用 (2, 3, 5-9)。5hmC已被提議在活躍的DNA脫甲基中作為中間體，例如通過(guò)脫氨基，或經(jīng)由利 用TET酶進(jìn)一步將5hmC氧化為5-甲酰基胞嘧啶（5fC)和5-羧基胞嘧啶（5cC)、隨后是涉 及胸腺嘧啶-DNA糖基酶（TDG)的堿基切除修復(fù)或在復(fù)制中未被保持標(biāo)記（10)。然而，5hmC 本身也可構(gòu)成表觀遺傳標(biāo)記。
[0003] 在總基因組DNA中，通過(guò)包括薄層色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的分析方法檢 測(cè)和定量5hmC的水平是可能的（2, 11，12)。因此，映射5hmC的基因組位置迄今為止是通過(guò) 富集法實(shí)現(xiàn)的，該富集法采用用于DNA片段的5hmC特異性沉淀的化學(xué)物質(zhì)或抗體，然后對(duì) DNA片段進(jìn)行測(cè)序（6-8、13-15)。這些拉下（pull-down)方法具有相對(duì)較差的分辨率（IOs 至IOOs的核苷酸），并且只給出相對(duì)的定量信息，這在富集中有可能受到分布式偏見(jiàn)。可量 化的5mC的單核苷酸序列已使用重亞硫酸鹽測(cè)序（BS-Seq)完成，所述重亞硫酸鹽測(cè)序利用 重亞硫酸鹽介導(dǎo)的脫氨基作用將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，對(duì)應(yīng)于這種脫氨基作用的5mC的轉(zhuǎn) 化是較慢的（16)。但是，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，5mC和5hmC在重亞硫酸鹽反應(yīng)中脫氨基都是很 慢的，因此這兩個(gè)堿基不能夠被區(qū)分（17,18)。兩個(gè)相對(duì)新的和簡(jiǎn)潔的單分子方法在單核苷 酸分辨率中檢測(cè)5mC和5hmC時(shí)顯示出希望。單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT)已經(jīng)示出能在基因組 DNA中檢測(cè)衍生的5hmC(19)。然而，必須對(duì)包含5hmC的DNA片段進(jìn)行富集，但該富集將導(dǎo) 致定量信息損失（19)。即使SMRT具有較低的精確度（19)，但仍可通過(guò)其檢測(cè)5mC。此外， SMRT具有相對(duì)高的測(cè)序錯(cuò)誤比率（20)，且修飾的峰值呼叫（calling)是不精確的（19)，并 且平臺(tái)還不能測(cè)序整個(gè)基因組。蛋白質(zhì)和固態(tài)納米孔可以溶解5hmC中的5mC，并且，利用進(jìn) 一步的開(kāi)發(fā)，有可能測(cè)序未擴(kuò)增的DNA分子（21，22)。
[0004] 已經(jīng)報(bào)道了使用"氧化重亞硫酸鹽"測(cè)序（"oxidative bisulfite" sequencing) (oxBS-Seq)的方法（23)在單核苷酸分辨率上對(duì)基因組DNA中的5hmC和5mC進(jìn)行定量映 射。這些方法涉及使用高釕酸鉀（KRuO 4)將5hmC特異性氧化為5fC。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)意識(shí)到例如為釕酸根的金屬（VI)氧基絡(luò)合物（metal ( VI) OXO complexe)在催化將多核苷酸中的5hmC殘基選擇性氧化為5fC殘基時(shí)是有用的。例 如，這在"氧化重亞硫酸鹽"分析和測(cè)序的方法中可能是有用的。
[0006] -方面，本發(fā)明提供了一種識(shí)別樣本核苷酸序列中修飾的胞嘧啶殘基的方法，所 述方法包括：
[0007] ( i )提供包括樣本核苷酸序列的多核苷酸群體，
[0008] ( ? )用金屬（VI)氧基絡(luò)合物處理所述群體的第一部分，
[0009] (iii)用重亞硫酸鹽處理所述群體的所述第一部分和所述群體的第二部分，然后
[0010] ( iv )識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣本核苷酸序列中胞嘧啶殘基的所述群體的第一核苷酸序 列和第二核苷酸序列中的殘基。
[0011] 在某些實(shí)施例中，所述殘基可通過(guò)測(cè)序被識(shí)別。例如，一種識(shí)別樣本核苷酸序列中 修飾的胞嘧啶殘基的方法，所述方法可以包括：
[0012] ( i )提供包括樣本核苷酸序列的多核苷酸群體，
[0013] ( ii )用金屬（VI)氧基絡(luò)合物處理所述群體的第一部分，
[0014] (iii)用重亞硫酸鹽處理所述群體的所述第一部分和所述群體的第二部分，
[0015] (iv)在步驟ii )和步驟iii)之后，測(cè)序所述群體的第一部分和第二部分中的多核 苷酸，以分別產(chǎn)生第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，然后
[0016] ( V )識(shí)別對(duì)應(yīng)于所述樣本核苷酸序列中胞嘧啶殘基的所述第一核苷酸序列和所 述第二核苷酸序列中的殘基。
[0017] 合適的測(cè)序方法在本領(lǐng)域中是已知的，并在下文詳細(xì)描述。
[0018] 在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中被識(shí)別的殘基可以表明樣本核苷酸序列 中對(duì)應(yīng)位置處的修飾的胞嘧啶，即，樣本核苷酸序列中某一位置處的修飾的胞嘧啶的存在 可以根據(jù)位于第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中相同位置處的殘基的類別（identity) 來(lái)測(cè)定。
[0019] 例如，胞嘧啶殘基可以存在于樣本核酸序列中一個(gè)或多個(gè)位置處。在第一核苷酸 序列和第二核苷酸序列的對(duì)應(yīng)位置處的殘基可以被識(shí)別?？梢杂蓸颖竞塑账嵝蛄兄邪奏?所在位置處的分別在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列中被識(shí)別的殘基的組合（即C和C、 U和U、C和U、或者U和C)來(lái)測(cè)定樣本核苷酸序列中胞嘧啶上例如5-取代的修飾的存在， 例如5-甲基或5-羥甲基取代。通過(guò)不同組合所表明的胞嘧啶的修飾如表1所示。
[0020] 用金屬（VI)氧基絡(luò)合物進(jìn)行處理能將多核苷酸的第一部分中的5-羥甲基胞嘧 啶（5hmC)殘基氧化為5-甲?；奏ぃ?fC)殘基。隨后通過(guò)步驟（iii)的重亞硫酸鹽處 理能將多核苷酸的第一部分中的5fC殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。在一些實(shí)施例中，用金屬（VI) 氧基絡(luò)合物進(jìn)行處理可以進(jìn)一步將一些或所有5-甲?；奏ぃ?fC)殘基氧化為5-羧基 胞嘧啶（5caC)殘基。通過(guò)步驟（iii)的重亞硫酸鹽處理也能將多核苷酸的第一部分中的 5caC殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。
[0021] 金屬（VI )氧基絡(luò)合物包括與一個(gè)或多個(gè)氧原子相配位的+6價(jià)氧化態(tài)的金屬原 子（M) 〇
[0022] 金屬（VI )原子可以是三配位的或四配位的，即M6+原子可以與三個(gè)氧原子相配 位（例如氧化錸Rh (VI)O3),或在含氧陰離子中與四個(gè)氧原子相配位（例如釕酸根Ru (VI) 〇，)。
[0023] 在優(yōu)選實(shí)施例中，金屬（VI)原子在含氧陰離子（MO42O中與四個(gè)氧原子相配位， 優(yōu)選以四面體構(gòu)型相配位。合適的金屬（VI)氧基絡(luò)合物包括錳酸根（Mn(VI)0，)、高鐵酸 根（Fe (VI) O42O、鋨酸根（Os (VI) O42O、釕酸根（Ru(VI)O42O 或鉬酸根（Mo (VI) O42O。
[0024] 在一些優(yōu)選實(shí)施例中，金屬（VI)氧基絡(luò)合物為釕酸根（Ru(VI)O4 2O或錳酸根 (Mn (VI) O42O，更優(yōu)選為釕酸根（Ru (VI) 04勹。
[0025] 可以通過(guò)任意合適的技術(shù)制備金屬（VI)氧基絡(luò)合物，并且本領(lǐng)域中多種方法都 是可用的。
[0026] 例如，在氧化羥甲基胞嘧啶（hmC)時(shí)適合使用的金屬（VI)氧基絡(luò)合物（M(VI) O42O可以通過(guò)相應(yīng)的金屬（VII)氧基絡(luò)合物或金屬（VIII)氧基絡(luò)合物（例如M(VII)CV或 M(VIII)O4)的還原來(lái)制備?？梢圆捎萌魏魏线m的還原方法，例如加熱或使用氫氧化物或過(guò) 氧化離子進(jìn)行處理。適合的金屬（VI)氧基絡(luò)合物（M(VI)O 42O也可以通過(guò)金屬氧化物和 氧基絡(luò)合物（例如MO2)的氧化來(lái)制備。
[0027] 例如，可以通過(guò)還原過(guò)釕酸根（Ru(VII)CV)或四氧化釕（Ru(VIII)O4)很方便地制 備釕酸根（Ru(VI)O 42O，例如使用碘化物、氫氧根（0Γ)、過(guò)氧根（0廣）或通過(guò)加熱來(lái)還原。還 可以通過(guò)釕化合物的氧化很方便地制備釕酸根，例如使用疆11〇 4或HClO (次氯酸）來(lái)氧化。 也可以由三氧化釕（RuO3)制備釕酸根（Ru (VI)O42O,例如使用堿水和過(guò)硫酸鹽來(lái)氧化。
[0028] 可以通過(guò)使用氫氧根（0Γ)、過(guò)氧根（0廣）或加熱來(lái)還原高錳酸根（Mn(VII)CV)從 而很方便地制備錳酸根（Mn (VI) 04勹。
[0029] 可以通過(guò)使用氫氧根來(lái)還原Os(VIII)O4W而制備鋨酸根（[Os(VI)O 4(OH)2]2)， (Os (VIII) 04+20Γ-> [Os (VI) O4 (OH)2]勹。
[0030] 可以通過(guò)加熱充滿硝酸鉀的鐵肩、或在堿性條件下加熱氫氧化鐵（III)和次氯酸 鹽、或通過(guò)堿性次氯酸氧化硝酸鐵來(lái)制備高鐵酸根（Fe(VI)O 42O。
[0031] 可以通過(guò)在堿中分解三氧化鉬來(lái)制備鉬酸根（Mo(VI)O42-)，（Mo0 3+2Na0H -Na2MoO4 ?乳0) 〇
[0032] 下文會(huì)更詳細(xì)地描述用于制備釕（VI)氧基絡(luò)合物和錳（VI)氧基絡(luò)合物的合適 方法的實(shí)施例。
[0033] 還可以由商業(yè)來(lái)源（例如，阿法埃莎（Alfa Aesar)，馬薩諸塞州MA，美國(guó)USA ;西 格瑪奧德里奇（Sigma Aldrich)，美國(guó)）獲得金屬（VI)氧基絡(luò)合物。
[0034] 用金屬（VI )氧基絡(luò)合物進(jìn)行處理，以選擇性地將多核苷酸群體的第一部分的 5_羥甲基胞嘧啶殘基氧化為5-甲?；奏埢?。在多核苷酸中，基本上沒(méi)有其它官能團(tuán) 被金屬（VI)氧基絡(luò)合物氧化。因此，所述處理沒(méi)有導(dǎo)致所存在的任何胸腺嘧啶或5-甲基 胞嘧啶殘基進(jìn)行反應(yīng)。
[0035] 可以用充足濃度的金屬（VI )氧基絡(luò)合物處理多核苷酸的第一部分，以選擇性氧 化多核苷酸中5-羥甲基胞嘧啶殘基?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)很容易地測(cè)定用于選擇性氧化 5-輕甲基胞喃啶的金屬（VI)氧基絡(luò)合物的合適濃度。例如，可以采用0.1 mM至10mM，更 優(yōu)選大約ImM的釕酸根。
[0036] 典型地，用于本文所述方法的金屬（VI)氧基絡(luò)合物以濃縮的貯存液進(jìn)行儲(chǔ)備，所 述貯存液的濃度例如可以是處理多核苷酸的第一部分時(shí)所用濃度的5倍、10倍、100倍、150 倍或500倍。典型的貯存液可以為IOOmM至150mM。
[0037] 通過(guò)金屬（VI)氧基絡(luò)合物氧化hmC殘基沒(méi)有將第一部分中的多核苷酸降解或損 害到會(huì)阻止第一部分進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增和/或測(cè)序的程度，即，在用金屬（VI)氧基絡(luò)合物進(jìn)行 處理后，第一部分包括足夠的完整無(wú)缺的或未受損害的多核苷酸以允許擴(kuò)增和/或測(cè)序， 即第一部分沒(méi)有被完全降解。
[0038] 優(yōu)選地，金屬（VI)氧基絡(luò)合物沒(méi)有引起、或只引起最低限度的第一部分中多核苷 酸的降解或損害，或沒(méi)有引起很大程度上的多核苷酸的降解或損害。
[0039] 多核苷酸的損害或降解可以包括磷酸二酯鍵的裂解、5'位脫磷酸和/或脫嘌呤。 用金屬（VI)氧基絡(luò)合物進(jìn)行處理可能不會(huì)引起很大程度上的第一部分中多核苷酸的磷酸 二酯鍵的裂解、5'位脫磷酸、脫嘧啶和/或脫嘌呤，優(yōu)選地只引起最低限度的、或沒(méi)有引起 磷酸二酯鍵的裂解、5'位脫磷酸和/或脫嘌呤。
[0040] 用金屬（VI)氧基絡(luò)合物進(jìn)行處理可能導(dǎo)致形成一些對(duì)應(yīng)的5-羧基胞嘧啶產(chǎn)物 以及5-甲?；奏?。這些產(chǎn)物的形成不會(huì)對(duì)本文所述的識(shí)別方法產(chǎn)生負(fù)面影響。在將 5-甲?；奏まD(zhuǎn)化為尿嘧啶所使用的重亞硫酸鹽的反應(yīng)條件下，觀察到5-羧基胞嘧啶 也被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶?？梢岳斫獾氖牵峒暗耐ㄟ^(guò)氧化5-羥甲基胞嘧啶而獲得的5-甲酰 基胞嘧啶可以是還包含有也通過(guò)氧化5-羥甲基胞嘧啶而獲得的5-羧基胞嘧啶的產(chǎn)物。
[0041] 有利地，處理?xiàng)l件還可以使多核苷酸維持在變性狀態(tài)，即可以采用變性條件。合適 的條件能在沒(méi)有引起多核苷酸損害或降解的情況下引起變性。例如，可以在堿性條件下，例 如50mM至500mM的NaOH或50mM至500mM的KOH條件下，用金屬（VI)氧基絡(luò)合物處理多 核苷酸。
[0042] 在用金屬（VI)氧基絡(luò)合物處理之后，可以對(duì)第一部分的多核苷酸進(jìn)行純化。 可以使用任何合適的核酸純化技術(shù)進(jìn)行純化。合適的核酸純化技術(shù)包括旋轉(zhuǎn)柱層析 (spin-column chromatography)〇
[0043] 多核苷酸可以經(jīng)受進(jìn)一步的、用金屬（VI)氧基絡(luò)合物處理的重復(fù)處理。進(jìn)行這 樣的步驟以最大化地將5-羥甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲酰基胞嘧啶。這對(duì)多核苷酸具有足夠 的、能夠進(jìn)行再熱處理的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能是必要的。多核苷酸的任何熱處理過(guò)的部分均可以 限制或阻止金屬（VI)氧基絡(luò)合物進(jìn)入到那部分的結(jié)構(gòu)中，這具有保護(hù)5-羥甲基胞嘧啶免 受氧化的效果。
[0044] 在一些實(shí)施例中，多核苷酸群體的第一部分例如可以經(jīng)受用金屬（VI )氧基絡(luò)合 物