來自海洋的芽孢桿菌ze01及其產低溫淀粉酶的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物，特別是一種分離自中國江蘇省連云港海域海泥的芽孢 桿菌sp. )ZE01;本發(fā)明還涉及該菌株產低溫淀粉酶的方法。
【背景技術】
[0002] a_淀粉酶（EC3. 2. 1. 1)是指一類作用于淀粉分子，從分子內部切開a_1，4糖苷 鍵，生成糊精和還原糖的水解酶，產物末端葡萄糖殘基C1碳原子為a_構型，故稱a_淀粉 酶。淀粉酶廣泛應用于食品、醫(yī)藥、洗滌、造紙、紡織及皮革等領域。低溫淀粉酶一般來源 于低溫微生物，通常情況下，在相對較低溫度范圍內，低溫淀粉酶的活性比相應的嗜溫淀粉 酶要高。目前研宄的淀粉酶主要是中高溫淀粉酶，這些酶只有在較高溫度下才具有較好的 催化活性，因而耗費能量巨大，如果采用低溫淀粉酶則可以節(jié)約能量，降低生產成本，符合 我國國情，研宄前景廣闊，逐漸成為人們研宄開發(fā)的熱點。因此從海洋環(huán)境中篩選高產低溫 a_淀粉酶的菌株，是今后研宄和開發(fā)低溫淀粉酶的關鍵。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種新的能產低溫淀粉 酶的來自海洋的芽孢桿菌ZE01。
[0004] 本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是提供上述芽孢桿菌ZE01產低溫淀粉酶的方 法。
[0005]本發(fā)明的特征包括來自海洋的芽孢桿菌sp. )ZE01菌株本身（以下稱菌 株ZE01)，以及利用該菌株發(fā)酵生產低溫淀粉酶的方法。
[0006] 本發(fā)明所涉及的菌株ZE01是在中國江蘇省連云港海域的海泥中分離到的芽孢桿 菌sp. )ZE01，該菌株已于2015年1月20日保藏在中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCCN0. 10375。保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號中國科學院微生物研宄所，聯(lián)系電話：010_64807355。
[0007] 以下對本發(fā)明進行詳細的闡述。
[0008] 一、本發(fā)明菌株ZE01的形態(tài)特征與生理生化特征。
[0009] 1. 1形態(tài)特征： 菌株ZE01為革蘭氏陽性芽孢桿菌（見圖1);在2216E固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，菌落 呈乳白色，表面干燥，有皺褶。在淀粉篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，加碘液后能產生明顯的透明 圈（見圖2)。
[0010] 1.2生理生化特征： 該菌株VP、明膠酶實驗、葡萄糖氧化實驗呈陽性，e-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴 氨酸脫羧酶鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫氨酶、脲酶實驗呈陰性，不利用檸檬酸，不產生硫化氫 和吲哚，不利用蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蜜二糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷，生理生化 結果見表1。
[0011] 表1菌株ZE01的生理生化特征
注：+:陽性；-:陰性 1. 3菌株ZE01的序列的擴增和分析： 用Generay試劑盒提取得到ZE01的基因組，選用擴增原核微生物16SrDNA序列的通用 引物（27F:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和 1492R: 5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'） 于PCRmix體系中反應。反應體系：PCRmix(46yL)，上下游引物（各lyL)，DNA模板 (2yL)。反應程序：94°C變性 5min; 94°C變性 30S，54°C退火 30S，72°C延伸 90S， 32個循環(huán)；72°C10min。將PCR電泳純化回收并構建克隆載體，選陽性克隆子提取質粒 送至南京思普金生物科技有限公司測序，將測得序列互補反相拼接后，獲得的1262bp堿基 片段序列，用MEGA5軟件進行16SrDNA序列的比對分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖3)，將該 序列與GenBank數據庫中的序列進行同源性比對，結果發(fā)現與芽孢桿菌屬最接 近。
[0012] 二、本發(fā)明菌株ZE01的生長特性 本發(fā)明提供的菌株ZE01，對其生長特性進行了細致的研宄，基本摸清不同條件下該菌 的生長情況。
[0013] 2. 1本發(fā)明中涉及的培養(yǎng)基： 2216E培養(yǎng)基：蛋白胨0. 5%，酵母粉0. 1%，陳海水配制，pH8 ; 淀粉篩選培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏〇. 5%，可溶性淀粉0. 2%，陳海水配制，pH8. 0 ; 產酶培養(yǎng)基：甘油〇. 5%，玉米淀粉0. 5%氯化銨0. 5%，NaCl0. 5%，pH7. 0。
[0014] 2. 2種子液的制備：將菌株ZE01斜面種子接種到2216E培養(yǎng)基中，30°C，180r/ min,裝液量20%，培養(yǎng)16h。
[0015] 2. 3培養(yǎng)時間對菌株ZE01生長的影響： 將種子液2%接種至2216E培養(yǎng)基中，pH8. 0, 30°C，180r/min培養(yǎng)48h，每隔4h取一次 樣，于〇D595下測定其菌濃度。菌株8h進入對數期，在24h進入穩(wěn)定期，見圖4。
[0016] 2. 4溫度對菌株ZE01生長的影響： 分別在不同溫度下培養(yǎng)24h，其余條件同2.3,測定0D值。該菌株生長溫度范圍為 15-45°C，最適生長溫度為30°C，見圖5。
[0017] 2. 5培養(yǎng)基pH對菌株ZE01生長的影響： 培養(yǎng)基pH范圍5. 0-10.0，最適溫度培養(yǎng)，其余條件同2. 3。生長pH范圍為5. 0-9.0， 最適生長pH為6.0,見圖6。
[0018] 2. 6NaCl濃度對菌株ZE01生長的影響： 培養(yǎng)基用自來水配制，NaCl濃度為0%-8%，在最適溫度和pH下培養(yǎng)，其余條件同 2. 3,菌株在NaCl濃度為0%-8%范圍內能生長，最適生長的NaCl濃度為0. 5%，見圖7。
[0019] 三、菌株ZE01發(fā)酵生產低溫淀粉酶的方法 發(fā)明人對菌株ZE01發(fā)酵生產低溫淀粉酶的方法進行了研宄。
[0020] 3. 1培養(yǎng)時間對菌株ZE01產酶影響： 將種子液以2%的接種量接種至2216E液體培養(yǎng)基內，30°C、180r/min搖床培養(yǎng)48h，每 隔4h取一次樣，測定酶活力。產酶時間為28h時間，產酶量達最高，見圖8。
[0021] 3. 2溫度對菌株ZE01產酶影響： 菌株ZE01在不同溫度（15°C、20°C、25°C、30°C、35°C)下培養(yǎng)28h，其余條件同3. 1，分 別測酶液的活力，最佳產酶溫度為25°C，結果見圖9。
[0022] 3. 3培養(yǎng)基pH對菌株ZE01產酶的影響： 將2216E液體培養(yǎng)基的pH調節(jié)至5. 0-10. 0。在25°C、180r/min下振蕩培養(yǎng)24h， 測酶活，該菌株在PH5. 0-8. 0范圍內產酶良好，最適產酶pH為7. 0,見圖10。
[0023] 3. 4NaCl濃度對菌株ZE01產酶的影響： 培養(yǎng)基用自來水配制，NaCl濃度0%-8%，在最適溫度和pH下培養(yǎng)，其余條件同3. 3， 測酶活，該菌株在NaCl濃度0%-6%產酶較好，最適產酶NaCl濃度為0. 5%，見圖11。
[0024] 3. 5碳氮源對菌株ZE01產酶的影響： 0. 5%的碳源(酵母粉，糊精，馬鈴薯淀粉，玉米淀粉，山芋淀粉，綠豆淀粉，乳糖，葡萄糖， 蔗糖，淀粉糖，麥芽糖，麩皮，甘油）和氮源(硫酸銨，氯化銨，豆柏粉，魚粉蛋白胨，胰蛋白胨， 干酪素，魚粉，花生柏，尿素）分別用于替換培養(yǎng)基中的酵母膏和蛋白胨，接種后在在30°C、 180r/min下振蕩培養(yǎng)24h，分別測酶液的活力。結果發(fā)現，甘油和玉米淀粉作為培養(yǎng)基碳 源可促進產低溫淀粉酶，而胰蛋白胨和氯化銨作為氮源時對產酶有促進作用，見圖12-13。
[0025] 3.6低溫淀粉酶活測定： 將50yL酶液加入到150yL1%的可溶性淀粉Tris-HCl緩沖液（50mmol/L，pH8. 0) 中，在30°C水浴中反應15 min，用DNS法測定還原糖量。酶活力單位定義（U/mL):在一定 溫度和pH下，每分鐘催化產lumoL還原糖的酶量為一個活力單位。
[0026] 與現有技術相比，本發(fā)明提供了一種新的芽孢桿菌)ZE01，該菌株可 以產低溫淀粉酶，所產酶性質穩(wěn)定，酶活性好，可以用于現有技術常規(guī)低溫淀粉酶的應用場 合，包括食品行業(yè)、飼料行業(yè)和環(huán)境治理行業(yè)。
【附圖說明】
[0027] 圖1為菌株ZE01掃描電鏡照片形態(tài)（X10 000)圖； 圖2為菌株ZE01在淀粉平板上形成的透明圈圖； 圖3為菌株ZE01系統(tǒng)進化樹； 圖4為時間對菌株ZE01生長的影響； 圖5為溫度對菌株ZE01生長的影響； 圖6為pH對菌株ZE01生長的影響圖； 圖7為NaCl濃度對菌株ZE01生長的影響圖； 圖8為時間對菌株ZE01發(fā)酵產酶的影響圖； 圖9為溫度對菌株ZE01發(fā)酵產酶的影響圖； 圖10為pH對菌株ZE01發(fā)酵產酶的影響圖； 圖11為NaCl濃度對菌株ZE01發(fā)酵產酶的影響圖； 圖12為不同碳源對菌株ZE01發(fā)酵產酶的影響圖； 圖13為不同氮源對菌株ZE01發(fā)酵產酶的影響圖。
【具體實施方式】
[0028] 以下進一步描述本發(fā)明的具體技術方案，以便于本領域的技術人員進一步地理解 本發(fā)明，而不構成對其權利的限制。
[0029] 實施例1，一種來自海洋的芽孢桿菌sp. )ZE01，CGMCC N0. 10375。該 菌株具有以下特征：菌株ZE〇l為革蘭氏陽性芽孢桿菌，在含淀粉的培養(yǎng)基上的菌落特征為 乳白色，表面干燥，有皺褶，邊緣整齊，淀粉平板加碘液后能產生明顯的透明圈。VP、明膠酶 實驗、葡萄糖氧化實驗呈陽性，0 _半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶鳥氨酸脫羧 酶、色氨酸脫氨酶、脲酶實驗呈陰性，不利用檸檬酸，不產生硫化氫和吲哚，不利用蔗糖、阿 拉伯糖、鼠李糖、蜜二糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷。菌株ZE01生長特性為：該菌株生 長溫度范圍為15-45°C，最適生長溫度為30°C;生長pH范圍為5-9,最適生長pH為6. 0 ;菌 株在NaCl濃度為0%-8%范圍內能生長，最適生長的NaCl濃度為0. 5%。
[0030] 實施例2, 一種如實施例1所述的來自海洋的芽孢桿菌ZE01產低溫淀粉酶的方法， 其步驟如下：將芽孢桿菌ZE01接種到2216E培養(yǎng)基中，轉速180r/min，裝液量20%，30°C培 養(yǎng)12h，得種子液；將種子液以2%的接種量接種于產酶培養(yǎng)基中，180r/min，30°C培養(yǎng)28h， lOOOOr/min離心5min，取上清液即為低溫淀粉酶粗酶；所述的產酶培養(yǎng)基的組成為：甘油 0? 5%，玉米淀粉 0? 5%，氯化銨 0? 5%，NaCl0? 5%，pH7. 0。
【主權項】
1. 一種來自海洋的芽孢桿菌（sp. ) ZE01，其特征在于：其保藏號為CGMCC NO. 10375 〇2. -種如權利要求1所述的來自海洋的芽孢桿菌（sp. )ZEOl產低溫淀粉酶 的方法，其特征在于，其步驟如下：將芽孢桿菌)ZE01接種到2216E培養(yǎng)基中， 轉速180r/min，裝液量20%，30°C培養(yǎng)12h，得種子液；將種子液以2%的接種量接種于產酶 培養(yǎng)基中，180r/min，30°C培養(yǎng)28h，10000r/min離心5min，取上清液即為低溫淀粉酶粗酶； 所述的產酶培養(yǎng)基的組成為：甘油〇. 5%，玉米淀粉0. 5%氯化銨0. 5%，NaCl 0. 5%，pH 7. 0。
【專利摘要】本發(fā)明是一種芽孢桿菌（Bacillus sp.）ZE01，CGMCC N0.10375。該菌株為革蘭氏陽性芽孢桿菌；菌落為乳白色，表面干燥，有皺褶，邊緣整齊。VP、明膠酶實驗、葡萄糖氧化實驗呈陽性，β-半乳糖苷酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶鳥氨酸脫羧酶、色氨酸脫氨酶、脲酶實驗呈陰性，不利用檸檬酸，不產生硫化氫和吲哚，不利用蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蜜二糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷。該菌株生長溫度范圍為15-45℃，菌株生長pH范圍為5-9；菌株生長NaCl濃度范圍是0%-8%。本發(fā)明還公開了一種利用菌株ZE01產低溫淀粉酶的方法。該低溫淀粉酶在飼料、環(huán)保等領域具有廣泛的應用前景。CGMCC N0.1037520150120
【IPC分類】C12R1/07, C12N1/20, C12N9/28
【公開號】CN104962503
【申請?zhí)枴緾N201510436666
【發(fā)明人】王淑軍, 呂明生, 田徑, 王小貝, 房耀維, 劉姝
【申請人】淮海工學院, 連云港杰瑞自動化有限公司
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年7月23日