一種麝鼠香腺分泌細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種麝鼠香腺分泌細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法及應(yīng)用，屬于細(xì)胞生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 麝鼠分泌的麝香也叫麝鼠香，其中含有與天然麝香相同的麝香酮、降麝香酮、烷酮 等主要成分，可廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)的中藥和香料領(lǐng)域。麝鼠香是由香腺分泌細(xì)胞所分泌的，因 此體外分離培養(yǎng)麝鼠香腺分泌細(xì)胞既可為研宄香腺的分泌機(jī)理提供試驗(yàn)材料，又可為體外 生產(chǎn)麝鼠香的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
[0003]目前關(guān)于體外分離培養(yǎng)麝鼠香腺分泌細(xì)胞的技術(shù)，多是采用相關(guān)蛋白酶消化后混 合培養(yǎng)的方法。這種方法使培養(yǎng)體系中即含有分泌細(xì)胞又含有支持細(xì)胞，又因?yàn)橹С旨?xì)胞 的分裂速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于分泌細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)過幾次傳代后，培養(yǎng)系統(tǒng)中所剩分泌細(xì)胞寥寥無幾， 給分泌細(xì)胞的純化及培養(yǎng)帶來很大的困擾。因此蛋白酶消化后混合培養(yǎng)的方法得到的分泌 細(xì)胞產(chǎn)量及質(zhì)量都不高，并極大的耗費(fèi)了時間、財(cái)力以及人力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決目前麝鼠香腺分泌細(xì)胞分離純化培養(yǎng)的不足，本發(fā)明提供了一種麝鼠香腺 分泌細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法及應(yīng)用，采用的技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種麝鼠香腺分泌細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法，該方法是采 取的處于泌香期的麝鼠的香腺組織，立即置于4°C預(yù)冷的含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩 沖溶液中進(jìn)行清洗處理，清除香腺的外圍組織，切割處理后的香腺組織并利用4°C預(yù)冷的含 有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行清洗后離心分離，再利用二型膠原酶進(jìn)行消化處 理，消化后離心分離，培養(yǎng)分離得到的沉淀組織。
[0006] 所述方法的步驟如下：
[0007] 1)采取處于泌香期的雄性麝鼠的香腺組織并立即將所得的香腺組織于4°C預(yù)冷 的含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行清洗處理，洗去表面殘留的香腺液，清洗 完將所得香腺浸泡于4°C預(yù)冷的含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液中；
[0008] 2)去除步驟1)所得香腺組織中得到外圍組織，并將組織移入含有4°C預(yù)冷的含有 青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液的培養(yǎng)皿中；
[0009] 3)利用動物組織切割器將切割步驟2)的香腺，并利用4°C預(yù)冷的含有青霉素和鏈 霉素的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行清洗，離心分離清洗后的香腺組織，棄去上清液；
[0010] 4)利用二型膠原酶對步驟3)離心得到的香腺組織進(jìn)行消化處理，處理后離心并 棄去上清液；
[0011] 5)利用DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)步驟4)分離得到的香腺組織沉淀。
[0012] 優(yōu)選地，所述4°C預(yù)冷的含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液，青霉素和鏈霉素 的濃度為500U/mL。
[0013]優(yōu)選地，步驟2)所述外圍組織，是香腺周圍殘留的脂肪、血管、結(jié)締組織及薄膜。 [0014] 優(yōu)選地，步驟3)所述利用動物組織切割器切割，是將所得香腺組織切割為厚度為 0. 7cm的組織碎片。
[0015] 優(yōu)選地，所述離心分離，是在lOOOrpm的條件下離心5min。
[0016] 優(yōu)選地，步驟4)所述利用二型膠原酶進(jìn)行消化處理，是使用離心所得香腺組織體 積4-6倍的150U的二型膠原酶進(jìn)行消化處理。
[0017] 優(yōu)選地，步驟5)所述利用DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)，是先在37°C、5%C02、飽和濕度 的條件下倒置培養(yǎng)4h，再加入胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)，第二天吸取并棄去胎牛血清后，加入新鮮 DMEM/F-12培養(yǎng)液，在37°C、5%C02、飽和濕度的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，再換液培養(yǎng)直至分泌細(xì)胞 匯集成片。
[0018] 所述方法的具體步驟如下：
[0019] 1)在無菌條件下采取處于泌香期的雄性麝鼠的香腺組織，并迅速將所得的香腺組 織置于4°C預(yù)冷的含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液中清洗3-5次，洗去表面殘留的 香腺液，清洗完再將所得香腺浸泡于l〇ml，4°C預(yù)冷的含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶 液中；
[0020] 2)去除步驟1)所得香腺組織周圍的殘留的脂肪、血管、結(jié)締組織及薄膜，再將組 織移入到經(jīng)過4°C預(yù)冷的10ml含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液的培養(yǎng)皿中；
[0021] 3)利用動物組織切割器將切割步驟2)的香腺切割為厚0. 7cm的香腺組織碎片， 并利用l〇ml4°C預(yù)冷的含有青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行清洗，去除殘留香腺液 后，再lOOOrpm條件下離心5min，棄去上清液；
[0022] 4)利用步驟3)所得香腺組織碎片總體積5倍的150U的二型膠原酶進(jìn)行消化處 理，處理結(jié)束后再于lOOOrpm條件下離心5min，棄去上清液；
[0023] 5)向步驟4)所得的消化香腺組織碎片中加入2ml新鮮DMEM/F-12培養(yǎng)液，吹打 均勻后于37°C、5%C02、飽和濕度的條件下倒置培養(yǎng)4h，培養(yǎng)結(jié)束后再加入500y1胎牛血 清，在于37°C、5%C02、飽和濕度的條件下正置培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)結(jié)束后將吸走胎牛血清后，加 入lml新鮮的DMEM/F-12培養(yǎng)液，再于37°C、5%C02、飽和濕度的條件下48h，培養(yǎng)結(jié)束后加 入5ml新鮮DMEM/F-12培養(yǎng)液，在37°C、5%C02、飽和濕度的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)更換培 養(yǎng)液直至香腺細(xì)胞從香腺組織碎片的周圍長出并匯集成片。
[0024] 所述任一方法用于獲取麝鼠香腺分泌細(xì)胞。
[0025] 本發(fā)明有益效果：
[0026] 1.麝鼠香腺分泌細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的現(xiàn)有培養(yǎng)技術(shù)多為蛋白酶消化法，步驟繁 瑣，費(fèi)時費(fèi)力。本發(fā)明簡化了麝鼠香腺分泌細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)步驟，只需得到均勻的小塊 香腺組織，直接就可以進(jìn)行培養(yǎng)操作，而且還能夠保證細(xì)胞的生長條件接近于體內(nèi)微環(huán)境。
[0027] 2.麝鼠香腺組織經(jīng)二型膠原蛋白酶短時消化后，可使組織塊周圍的結(jié)締組織離 散，暴露出香腺組織的分泌單元，從而使分泌單元的主要成分-分泌細(xì)胞從分泌單元周圍 爬出，并在本專利培養(yǎng)條件下快速成片生長。在此條件下的細(xì)胞大部分都是分泌細(xì)胞，可簡 單快速的得到純度較高的分泌細(xì)胞，極大的縮短了分泌細(xì)胞分離純化的過程。
【附圖說明】
[0028] 圖1為實(shí)施例1香腺組織塊及其周圍生長的分泌細(xì)胞。
[0029] 圖2為實(shí)施例3香腺分泌細(xì)胞及其周圍的支持細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0031] 以下實(shí)施例所使用的材料、試劑、方法和儀器，未經(jīng)特殊聲明，均為本領(lǐng)域常規(guī)的 材料、試劑、方法和儀器，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0032] 本發(fā)明所用的動物組織切割器械是根據(jù)專利號為ZL201420335401. 8的專利制作 獲得的。實(shí)施例1
[0033] 1)將試驗(yàn)用6月齡處于泌香期的麝鼠中香腺組織于無菌環(huán)境中取出，并迅速置于 4°C預(yù)冷的500U/ml青、鏈霉素PBS中，沖洗5次后備用；
[0034] 2)去除香腺組織周圍殘留的脂肪、血管及結(jié)締組織，剝?nèi)ハ阆俳M織外圍的薄膜，用 動物組織切割器械將香腺組織切成厚度為0. 7cm的均勻小塊組織；
[0035] 3)使用4°C預(yù)冷的500U/ml青、鏈霉素PBS清洗厚度為0. 7cm的均勻小塊香腺組 織，清洗8次后，觀察上清液由渾濁變?yōu)槌吻澹?000rpm/min離心5min，棄上清；
[0036] 4)向裝有小塊香腺組織的15ml的離心管中加入5ml的150U的二型膠原蛋白酶， 吹打均勾后，迅速置于離心機(jī)中l(wèi)〇〇〇rpm/min離心5min，棄上清；
[0037] 5)加入2ml新鮮DMEM/F-12培養(yǎng)液，吹打均勻后，使用移液管將組織均勻的鋪在 規(guī)格為25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶倒置后棄去殘余培養(yǎng)液，于37°C、5%C02、飽和濕度 的條件下倒置培養(yǎng)4h;
[0038] 6)4h后，向鋪有小塊香腺組織的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入500y1的胎牛血清，于37°C、 5%C02、飽和濕度的條件下正置過夜培養(yǎng)香腺組織塊；
[0039] 7)培養(yǎng)17h后，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中500y1的胎牛血清吸走，加入1ml新鮮DMEM/F-12 培養(yǎng)液，于37°C、5%C02