珠子參皂苷誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞及治療肝病藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及珠子參皂苷誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞及治療肝 病藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)由于乙型肝炎病毒感染率較高，感染者進(jìn)而罹患急慢性肝炎、肝纖維化乃至 肝硬化、肝癌的事件屢見(jiàn)不鮮，肝臟疾病目前已經(jīng)成為中國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生的主要負(fù)擔(dān)之一。肝臟 疾病進(jìn)展到肝硬化等終末期肝?。╡nd-stageliverdisease,ESLD)時(shí)，通常累及廣泛肝實(shí) 質(zhì)細(xì)胞，肝組織再生能力下降，造成肝功能失代償并最終導(dǎo)致肝功能衰竭。常規(guī)的內(nèi)科保肝 治療效果不佳，病死率很高。目前，原位肝移植術(shù)是治療ESLD最有效的方法，雖然近期療效 較好，但由于手術(shù)復(fù)雜、器官來(lái)源困難、費(fèi)用高昂、免疫排斥反應(yīng)及長(zhǎng)期使用免疫抑制劑等 因素，使其臨床廣泛應(yīng)用受到了一定的限制。近年來(lái)干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為治療終末期肝病 帶來(lái)了新的希望。干細(xì)胞療法因其簡(jiǎn)單易行，創(chuàng)傷小而成為關(guān)注的焦點(diǎn)。骨髓干細(xì)胞移植 在治療急慢性肝功能衰竭、終末期肝病及遺傳代謝性肝病等方面有了很大的進(jìn)展，其在近 期療效、安全性、耐受性等方面獲得了肯定，且因其本身的優(yōu)勢(shì)（如費(fèi)用低廉、取材方便、不 存在免疫排斥反應(yīng)等）而越來(lái)越受到重視。雖然肝移植是治療各種終末期肝病的有效方 法，但由于供肝來(lái)源不足、操作復(fù)雜、并發(fā)癥多、移植后免疫排斥及治療費(fèi)用昂貴等原因， 限制了臨床肝移植的發(fā)展。因此，自開(kāi)展干細(xì)胞研宄以來(lái)，骨髓干細(xì)胞（bonemarrowstem cells,BMSCs)移植為ESLD患者帶來(lái)了福音。
[0003] 干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化潛能的原始細(xì)胞。根據(jù)其生存階段可以分 為胚胎干細(xì)胞和BMSCs。胚胎干細(xì)胞具有全能性，可分化為體內(nèi)所有的組織細(xì)胞，但是，干細(xì) 胞的定向分化是在細(xì)胞內(nèi)外因素的共同作用下完成的，細(xì)胞_細(xì)胞間的相互作用及某些生 長(zhǎng)因子可促使干細(xì)胞向某一方向分化，因此，在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中，很難確保其向單一方 向分化，研宄發(fā)現(xiàn)這種全能干細(xì)胞移植后有形成腫瘤（如畸胎瘤）的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)又因?yàn)閭惱?問(wèn)題，限制了其在臨床上的發(fā)展應(yīng)用。近年來(lái)許多科學(xué)家都先后證實(shí)BMSCs的分化能力是 最接近胚胎干細(xì)胞的成體干細(xì)胞，可以分化成為心、肝、腦、肌肉、軟骨、胰島等多種體細(xì)胞。 BMSCs因其來(lái)源豐富，自體移植可避免疫排斥反應(yīng)，不涉及倫理等諸多優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注，充 分開(kāi)發(fā)利用BMSCs，將為心、肝、腦等重要器官致命性疾病的治療開(kāi)辟一條新的道路。Jiang 等人研宄發(fā)現(xiàn)BMSCs可定向誘導(dǎo)分化為肝樣細(xì)胞，這種細(xì)胞具有正常肝細(xì)胞的形態(tài)和功能 特點(diǎn)，可合成白蛋白、甲胎蛋白、尿素等。雖然也有肝干細(xì)胞、臍血干細(xì)胞等應(yīng)用于臨床治療 ESLD的報(bào)道。我國(guó)也早在20世紀(jì)中葉就已經(jīng)開(kāi)展中藥對(duì)BMSCs的生物學(xué)影響研宄，應(yīng)用中 藥治療血液病、抗放化療副作用等取得了很好的臨床效果。
[0004] 珠子參（Panaxjaplcusvar,major)系五加科人參屬植物。別名扣子七、鈕子七、 竹鞭三七、疙瘩七、土三七、盤(pán)七、野三七等。民間習(xí)用其干燥根狀莖入藥。其味苦、甘，微寒， 歸肝、肺、胃經(jīng)，具有補(bǔ)肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛、止血等功效，主治氣陰兩虛、煩熱口渴、虛勞咳嗽、 關(guān)節(jié)痹痛、咳血、吐血、衄血、崩漏及外傷出血等。對(duì)其化學(xué)成分研宄表明，其主要化學(xué)成分 為皂苷類(lèi)，分為齊墩果烷型、達(dá)瑪烷型、留類(lèi)，包括珠子參皂苷K1和K2,竹節(jié)參苷、20-0-葡 萄糖基-人參皂苷Rf、人參皂苷R〇、人參皂苷Kd、Re、Rc、Rb、Rgl、Rb3、Rg2,人參皂苷F1~ F3、20(S)_假人參皂苷Fll、珠子參皂苷FI~F6、羽葉三七苷、三七苷Sap-3為0-谷甾 醇-3-0-0-D-吡喃葡萄糖苷。齊墩果酸-28-0-0-D-毗哺葡萄糖苷、齊墩果酸、谷甾 醇-3-0-D-毗喃葡萄糖苷、0 -谷留醇等；其次為多糖、倍半萜類(lèi)以及人體必需微量元素Fe、 Cu、Zn、Mn、Ni、Co、Mo等。
[0005] 珠子參及其主要成分珠子參總皂苷具有較廣泛的藥理作用，對(duì)血液及造血系統(tǒng)、 消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤、心血腦管系統(tǒng)等均有作用。我們研宄發(fā)現(xiàn)，珠子參有較顯著的抗 腫瘤活性，證實(shí)珠子參能扶持機(jī)體正氣，恢復(fù)或改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，正向調(diào)節(jié)NK-IL-2 軸功能，并通過(guò)促胸腺細(xì)胞增生分化為成熟T細(xì)胞向外周釋放，進(jìn)一步提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié) 因子水平，促進(jìn)抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的活性，以清除或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展；能誘發(fā)人肝癌細(xì)胞 株SMMC27721產(chǎn)生典型的凋亡形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)變化；可使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而阻止細(xì) 胞向S期轉(zhuǎn)換，干擾細(xì)胞周期進(jìn)程，并顯著引起細(xì)胞凋亡，降低癌基因c-myc和c-fos表達(dá)， 增高抑癌基因P53和p21表達(dá)。
[0006]目前，雖有關(guān)于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞的報(bào)道材料，但是針對(duì)珠子參皂苷誘導(dǎo) 干細(xì)胞分化肝細(xì)胞及治療肝病的應(yīng)用方面的研宄還未見(jiàn)報(bào)道。珠子參對(duì)肝損傷具有良好 的療效，并證實(shí)珠子參皂苷能誘導(dǎo)BMSCs分化為肝細(xì)胞，但目前有關(guān)珠子參皂苷如何動(dòng)員 BMSCs向受損肝臟募集、歸巢，如何改善病變肝細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)募集BMSCs的存活及分化 為肝樣細(xì)胞，從而修復(fù)受損肝臟，恢復(fù)受損肝臟功能的機(jī)制研宄還少有報(bào)道；我國(guó)是肝病大 國(guó)，肝硬化、肝癌和肝衰竭已成為眾多ESLD患者的最終歸宿。干細(xì)胞移植為治療終末期肝 病提供了新的希望，利用干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的研宄也就成為現(xiàn)階段亟待解決的問(wèn)題，而治 療肝病方面的藥物也有著廣泛的市場(chǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的主要目的之一在于滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，解決干細(xì)胞分化肝細(xì)胞難實(shí)現(xiàn)和肝病 難于治療的問(wèn)題，從而提供珠子參皂苷的新用途，即珠子參皂苷誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞及 治療肝病藥物的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明開(kāi)發(fā)了珠子參皂苷的新用途，包括：利用珠子參皂苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞定向分化為肝細(xì)胞；利用珠子參皂苷研制治療肝病及中晚期肝癌的藥物。本發(fā)明還提供 了利用珠子參皂苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為肝細(xì)胞的實(shí)現(xiàn)方法。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0010] 珠子參阜苷誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的應(yīng)用，從珠子參中提取的珠子參阜苷在制備 誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。
[0011] 進(jìn)一步的，珠子參皂苷誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的應(yīng)用，所述干細(xì)胞為成體干細(xì)胞。
[0012] 進(jìn)一步的，珠子參皂苷誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的應(yīng)用，所述成體干細(xì)胞為骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞。
[0013] 進(jìn)一步的，珠子參皂苷誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的應(yīng)用，所述干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞 誘導(dǎo)液的主要成分包括珠子參皂苷、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)、骨細(xì)胞方向分化的誘導(dǎo)液。
[0014] 一種珠子參皂苷誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的應(yīng)用方法：取大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取穩(wěn)定的傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得 成熟的肝細(xì)胞樣細(xì)胞；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加有珠子參皂苷與細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)培養(yǎng) 基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中珠子參皂苷與細(xì)胞生長(zhǎng)因子的添加量為：珠子參皂苷的濃度為： 50-200yg/mL，細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)的濃度為：10-30ng/mL。
[0015] 優(yōu)選的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加的細(xì)HGF的濃度為：20ng/mL。
[0016] 進(jìn)一步的，珠子參皂苷誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的應(yīng)用方法，取大鼠骨髓間充質(zhì)干 細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第三代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，接種于低糖DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件 為：，當(dāng)所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單層長(zhǎng)到80%后，將所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基更換 為含有珠子參皂苷與細(xì)胞生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3天換液1次，培養(yǎng)2 周后，獲得成熟的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
[0017] 一種誘導(dǎo)干細(xì)胞分化肝細(xì)胞的誘導(dǎo)劑，所述誘導(dǎo)劑含有珠子參或珠子參皂苷。
[0018] 一種珠子參皂苷在治療肝病中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為珠子參皂苷在治療肝病中的藥 物組合物中的應(yīng)用。
[0019] 一種治療肝病中的藥物組合物，所述治療肝病中的藥物組合物中含有珠子參皂 苷；所述藥物組合物的制劑形式包括：注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、 軟膏劑、控釋劑、緩釋劑或納米制劑。
[0020] 本發(fā)明的有益效果為：開(kāi)發(fā)了珠子參皂苷的新用途：利用珠子參皂苷誘導(dǎo)骨髓間 充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化為肝系細(xì)胞，分化穩(wěn)定，效果好；將珠子參皂苷應(yīng)用于治療肝病的 藥物中，進(jìn)一步的明晰珠子參皂苷的藥理和藥效，為新藥的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1所示為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs)細(xì)胞形態(tài)圖：A:染色前BMSCs細(xì)胞形態(tài)圖、 B:染色后BMSCs細(xì)胞形態(tài)圖；
[0022] 圖2為BMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)；
[0023] 圖3珠子參皂苷誘導(dǎo)BMSCs分化后細(xì)胞形態(tài)圖：A:空白組、B:珠子參皂苷200yg/ mL組；
[0024] 圖4珠子參皂苷誘導(dǎo)BMSCs分化后細(xì)胞合成糖原的影響圖：A:空白組、B:珠子參 皂苷200yg/mL組；
[0025] 圖5珠子參皂苷誘導(dǎo)BMSCs分化7天后細(xì)胞AFP、Albumin、CK18蛋白表達(dá)的影響 圖：1 :空白組、2 :HGF組、3 :珠子參皂苷50yg/mL組、4 :珠子參皂苷100yg/mL組、5 :珠子 參皂苷200yg/mL組；
[0026] 圖6珠子參皂苷誘導(dǎo)BMSCs分化14天后細(xì)胞AFP、Albumin、CK18蛋白表達(dá)的影響 圖：1 :空白組、2 :HGF組、3 :珠子參皂苷50yg/mL組、4 :珠子參皂苷100yg/mL組、5 :珠子 參皂苷200yg/mL組；
[0027] 圖7珠子參皂苷對(duì)BMSCs在肝纖維化模型大鼠肝組織募集的影響圖；
[0028] 圖8珠子參皂苷及BMSCs移植對(duì)肝纖維化模型大鼠肝纖維化的HE染色影響圖：A: 正常組、B:模型組、C:BMSCs移植組、D:珠子參皂苷組、E:BMSCs移植+珠子參皂苷組；
[0029] 圖9珠子參皂苷及BMSCs移植對(duì)肝纖維化模型大鼠肝組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響： 1 :正常組、2 :模型組、3 :BMSCs移植組、4 :珠子參皂苷組、5 :BMSCs移植+珠子參皂苷組。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下文將結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述的 技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是孤立的，它們可以被