一種測(cè)定非同源末端連接修復(fù)活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種測(cè)定非同源末端連接修復(fù)活性的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]非同源末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)是一種細(xì)胞修復(fù)DNA雙鏈斷裂的通路，該修復(fù)過程不需要模版染色體的參與，能夠直接重新連接兩個(gè)斷裂的DNA末端。然而與另外一種同源重組(Homologous recombinat1n, HR)修復(fù)不同，NHEJ修復(fù)往往伴隨著核苷酸的插入或缺失，從而使基因發(fā)生突變，失去基因的功能。
[0003]DNA作為遺傳信息的保存者，其完整性對(duì)細(xì)胞來說至關(guān)重要。多種內(nèi)源或外源因素都能造成細(xì)胞基因組DNA損傷，細(xì)胞內(nèi)具有應(yīng)對(duì)不同形式損傷的復(fù)雜的修復(fù)系統(tǒng)。其中DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks, DSBs)作為最嚴(yán)重最致命的損傷形式，如果沒有被及時(shí)修復(fù)，將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在腫瘤的臨床治療中，放療和多數(shù)化療藥物可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，腫瘤細(xì)胞主要通過NHEJ和HR修復(fù)來對(duì)斷裂的DNA雙鏈進(jìn)行修復(fù)，其中NHEJ不存在細(xì)胞周期依賴性，是細(xì)胞中修復(fù)DNA雙鏈斷裂的主要方式，其活性在一定程度上決定了腫瘤細(xì)胞對(duì)電離輻射和化療藥物的敏感性，當(dāng)腫瘤細(xì)胞中的NHEJ修復(fù)活性被抑制后，放療和化療的效果能得到明顯的改善。
[0004]目前可以用來測(cè)定NHEJ活性的方法主要有DNA雙鏈斷裂特異性蛋白γ H2AX和53ΒΡ1染色，DNA斷裂片段的中性彗星電泳，以及采用比較復(fù)雜的分子生物學(xué)手段來研宄NHEJ的活性，如在大范圍核酸酶1-SceI基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的針對(duì)NHEJ修復(fù)活性的報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，再引入1-SceI核酸酶進(jìn)行DNA雙鏈斷裂的誘導(dǎo)，最后通過觀察報(bào)告質(zhì)粒的焚光表達(dá)來反應(yīng)NHEJ修復(fù)的能力(Identificat1n ofNovel Rad1sensitizers in a High-Throughput, Cell-Based Screen for DSB RepairInhibitors，Alexander G，《Molecular Cancer Therapeutics》第 14 卷，第 326-342 頁，2015年2月)。但是上述這些方法比較復(fù)雜且步驟繁多，而且需要一些特異性的染色以及對(duì)特定細(xì)胞株的篩選。
[0005]基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)目前發(fā)展迅速，現(xiàn)在主要有三種類型，鋅指核酸內(nèi)切酶(Zinc finger nucleases, ZFNs)，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcript1nactivator-like effector nucleases，TALENs)，規(guī)律性重復(fù)短序列叢集及其系統(tǒng)(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR/CRISPRassociated system, Cas9)，這些技術(shù)可以對(duì)基因組中特定的DNA位點(diǎn)進(jìn)行切斷，通過誘導(dǎo)NHEJ或HR修復(fù)來達(dá)到對(duì)基因定點(diǎn)編輯的目的，而且突變效率高、制作簡(jiǎn)單、成本較低。因此如何利用基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)來簡(jiǎn)明的測(cè)定非同源末端連接修復(fù)活性成為當(dāng)前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定非同源末端連接修復(fù)活性的方法。
[0007]次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine-guaninephosphoriboSyItransferase, HPRT)參與細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸生物合成的補(bǔ)救途徑，6_硫代鳥嘌呤(6-Th1guanine，6-TG)能在該酶的作用下?lián)饺隓NA中，從而抑制DNA合成，使細(xì)胞無法存活。如果用上述基因定點(diǎn)編輯技術(shù)在HPRT基因上造成DNA雙鏈斷裂，當(dāng)HPRT基因通過NHEJ修復(fù)發(fā)生突變后，可使細(xì)胞在含有6-TG的培養(yǎng)基中存活，而沒有發(fā)生NHEJ修復(fù)而突變的細(xì)胞則不能在含有6-TG的培養(yǎng)基中存活，這樣存活細(xì)胞的數(shù)量及活力就反映了 NHEJ修復(fù)水平的高低。
[0008]本發(fā)明的原理是采用基因定點(diǎn)突變技術(shù)(ZFN，TALEN或CRISPR/Cas9)在HPRT基因上誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，當(dāng)HPRT基因的斷裂點(diǎn)發(fā)生NHEJ修復(fù)時(shí)，會(huì)發(fā)生基因突變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)HPRT功能失活。正常細(xì)胞在HRPT失活后并不會(huì)影響細(xì)胞的功能，但是在含有6-TG的培養(yǎng)基中，6-TG可以在HPRT的作用下?lián)饺隓NA引起細(xì)胞死亡，而發(fā)生NHEJ后突變的細(xì)胞由于HPRT基因功能失活，可以抵抗6-TG的毒性而存活下來，最終可以通過檢測(cè)細(xì)胞的活力來了解細(xì)胞的NHEJ修復(fù)活性。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0010]一種測(cè)定非同源末端連接修復(fù)活性的方法，包括下述步驟:
[0011]一種測(cè)定非同源末端連接修復(fù)活性的方法，包括下述步驟:
[0012](I)采用TALEN技術(shù)或CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建針對(duì)次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒；
[0013](2)對(duì)(I)中構(gòu)建所得的質(zhì)粒結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞采用非同源末端連接修復(fù)分子抑制劑進(jìn)行處理，得到經(jīng)抑制處理的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；
[0014](3)將⑵中所得的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用含有6-硫代鳥嘌呤的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；
[0015](4)在經(jīng)(3)處理好的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中加入MTT溶液，待藍(lán)色甲臜顆粒形成后用DMSO溶解，然后采用酶標(biāo)儀測(cè)定其在0D570nm的吸光值。
[0016]其進(jìn)一步的技術(shù)方案是:
[0017]步驟(I)中采用TALEN技術(shù)構(gòu)建針對(duì)次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒時(shí)，所設(shè)計(jì)打靶基因的左臂識(shí)別序列為SEQ ID NO: 1，設(shè)計(jì)打靶基因的右臂識(shí)別序列為SEQID N0:2o
[0018]步驟(I)中采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建針對(duì)次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的質(zhì)粒時(shí)，所設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)引物的正向引物序列為SEQ ID N0:3，所設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)引物的反向引物序列為SEQ ID NO:4。
[0019]步驟(2)中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293T細(xì)胞，所述非同源末端連接修復(fù)分子抑制劑為非同源末端連接修復(fù)分子DNA-PK的抑制劑NU7441和DNA-PKcs siRNA中的一種，且所述DNA-PKcs siRNA 的基因序列為 SEQ ID N0:5。
[0020]步驟(2)中對(duì)(I)中構(gòu)建所得的質(zhì)粒結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞采用非同源末端連接修復(fù)分子抑制劑進(jìn)行處理是指:將步驟(I)中構(gòu)建所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并對(duì)轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞采用非同源末端連接修復(fù)分子DNA-PK抑制劑NU7441處理。
[0021]步驟⑵中進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的過程包括:將293T細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，當(dāng)該細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，采用Lipofectamine 3000作為轉(zhuǎn)染試劑將(I)中構(gòu)建所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。
[0022]步驟⑵中對(duì)⑴中構(gòu)建所得的質(zhì)粒結(jié)合哺乳動(dòng)物細(xì)胞采用非同源末端連接修復(fù)分子抑制劑進(jìn)行處理是指:將步驟(I)中構(gòu)建所得的質(zhì)粒和DNA-PKcssiRNA共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。
[0023]步驟(2)中進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的過程包括:將293T細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，當(dāng)該細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，采用Lipofectamine 3000作為轉(zhuǎn)染試劑將(I)中構(gòu)建所得的質(zhì)粒和DNA-PKcs siRNA 共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞。
[0024]借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明所述方法采用基因定點(diǎn)突變技術(shù)來對(duì)HPRT基因進(jìn)行突變，之后需要質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、藥物處理、6-TG處理步驟，最后通過簡(jiǎn)單的細(xì)胞活力檢測(cè)來觀察NHEJ修復(fù)的活性，這種方法可以通過檢測(cè)細(xì)胞活力來觀察細(xì)胞NHEJ修復(fù)的活性水平，可用于篩選不同藥物、不同基因?qū)HEJ修復(fù)的作用，測(cè)定不同細(xì)胞系對(duì)NHEJ活性抑制藥物和基因的反應(yīng)，從而可以發(fā)現(xiàn)具有化療和放療增敏效果的藥物和基因。
[0025]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。
【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明測(cè)定NHEJ活性的方法的技術(shù)方案圖；
[0027]圖2為本發(fā)明中不同濃度NU7441對(duì)NHEJ修復(fù)活性的影響；
[0028]圖3為本發(fā)明中2.0 μ mo I/L NU7441處理不同時(shí)間對(duì)NHEJ修復(fù)活性的影響；
[0029]圖4為本發(fā)明中DNA-PKcs siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)NHEJ修復(fù)活性的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述，以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0031]下述具體實(shí)施例中TALEN構(gòu)建試劑盒購(gòu)自斯丹賽生物技術(shù)有限公司，CRISPR/Cas9構(gòu)建試劑盒購(gòu)自唯尚立德生物技術(shù)有限公司，NHEJ修復(fù)分子DNA-PK抑制劑NU7441購(gòu)自Selleck公司，DNA-PKcs siRNA由吉瑪基因公司合成，引物由invitrogen上海公司合成，用蒸飽水配置成10 μ mol/L，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購(gòu)自invitrogen上海公司，MTT購(gòu)自上海生工生物工程公司。
[0032]具體實(shí)施例一:
[0033]采用TALEN技術(shù)測(cè)定不同濃度NU7441對(duì)NHEJ的抑制作用，其具體步驟為:
[0034](I)構(gòu)建針對(duì)HPRT基因的TALEN質(zhì)粒。具體步驟為:按照TALEN設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)打靶HPRT基因的左臂和右臂識(shí)別序列，左臂識(shí)別序列:ATGACCTTGATTTA(SEQ ID NO:1)，右臂識(shí)別序列:CCAAATCCTCAGCA(SEQ ID NO:1)，按照TALEN構(gòu)建試劑盒的方法，將兩個(gè)識(shí)別序列插入相應(yīng)的骨架載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，均勻涂布于卡那霉素抗性(20yg/ml)