一種水稻葉片衰老調(diào)控基因OsNaPRT1及其編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及水稻葉片衰老調(diào)控基因 OsNaPRTI(Oryzasativanicotinatephosphoribosyltransferase1)及其編石馬的蛋白質(zhì) 與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)于植物葉片衰老的機(jī)理存在著多種假說(shuō)，如：光碳失衡說(shuō)、自由基傷害說(shuō)、營(yíng)養(yǎng) 脅迫說(shuō)、激素平衡說(shuō)以及基因調(diào)控說(shuō)等等，這些假說(shuō)分別從不同角度闡述了葉片衰老的可 能機(jī)理。衰老相關(guān)基因可細(xì)分為兩類(lèi)：其中一類(lèi)僅在衰老階段才出現(xiàn)表達(dá)，這類(lèi)基因被稱(chēng) 為衰老特定基因（SSGs)，它們的mRNA只有在葉片衰老時(shí)才能被檢測(cè)到，如SAG12、SAG13和 LSC54 ;另一類(lèi)是SAGs(衰老相關(guān)基因），它們?cè)谌~片生長(zhǎng)初期就可檢測(cè)到有低水平表達(dá)， 衰老開(kāi)始后表達(dá)量迅速上升。為了闡明衰老的機(jī)理，科研工作者已經(jīng)針對(duì)自然界中數(shù)百個(gè) SAGs進(jìn)行了廣泛的基因組范圍研宄。
[0003] 水稻作為重要的食物資源，它的產(chǎn)量的高低與人們的生活息息相關(guān)，提高水稻的 單產(chǎn)一直是科研人員奮斗的目標(biāo)。研宄發(fā)現(xiàn)：如果水稻葉片衰老的過(guò)程推遲，水稻的產(chǎn)量將 會(huì)得到提高。目前，水稻中已有大量的衰老相關(guān)基因被克隆，但是衰老過(guò)程中的諸多機(jī)理還 是不甚清晰。某項(xiàng)研宄表明，植物葉片衰老的過(guò)程有一方面與NAD的合成和補(bǔ)償途徑有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能影響水稻葉片衰老進(jìn)程的蛋白質(zhì)及其基 因，以及由此獲得的重組載體、轉(zhuǎn)化體，和利用該基因?qū)λ救~片衰老進(jìn)行延遲的方法以及 該基因的應(yīng)用。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種水稻葉片衰老調(diào)控基因OsNaPRTI編 碼的蛋白質(zhì)，如（A)或（B)所示的序列：
[0006] (A)SeqIDNo:2所示的氨基酸序列；
[0007] (B)在（A)所限定的氨基酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有調(diào) 控水稻葉片衰老功能的由（A)衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的基因。
[0009] 作為進(jìn)一步地改進(jìn)，上述基因，如（a)或（b)所示的序列：
[0010](a)SEQIDNo:1所示的核苷酸序列；
[0011] (b)在（a)所限定的核苷酸序列中添加、取代或缺失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸而生成的 可編碼具有調(diào)控水稻葉片衰老功能的蛋白質(zhì)的突變基因、等位基因或衍生物；
[0012] 本發(fā)明還提供了一種含有上述基因的重組載體。
[0013]作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述載體為pCAMBIA1300。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種含有上述基因的轉(zhuǎn)化體。
[0015] 作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述轉(zhuǎn)化體的宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞或農(nóng)桿菌細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種調(diào)控水稻葉片衰老的方法，包括用上述基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞， 再將轉(zhuǎn)化后的水稻細(xì)胞培育成植株。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種上述基因在調(diào)控植物葉片衰老、株高和/或粒型中的應(yīng)用。
[0018] 作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述植物為單子葉植物。
[0019] 進(jìn)一步具體說(shuō)明：本發(fā)明的目的是提供一種從水稻突變體osnaprtl中克隆的新 基因OsNaPRTl，如圖7和SEQIDNo:l所示的DNA序列，也包括與SEQIDNo:l所示的DNA 序列至少有70%同源性的基因序列。本發(fā)明中的SEQIDNo:2和圖8所不的蛋白質(zhì)屬于一 類(lèi)表達(dá)蛋白，其中進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的替換、插入或缺失所獲得的功能類(lèi)似物。另外， 也包括在SEQIDNo:1中取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸而生成的突變體、等位基因或 衍生物，具有相同功能的序列也能達(dá)到本發(fā)明的目的。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用OsNaPRTl基因進(jìn)行高效的植物轉(zhuǎn)化的方法， 具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了具有SEQIDNo:1和圖7所示的序列的基因或基因部分片段的重 組載體及轉(zhuǎn)化體，其中，如圖4所示的pCAMBIA1300-0sNaPRT1，該載體可以表達(dá)有上述核苷 酸序列編碼的多肽或其同源類(lèi)似物。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種利用植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞影響水稻葉片衰老的方法。 本發(fā)明還提供了OsNaPRTl基因的應(yīng)用，具體地是利用其調(diào)控葉片衰老、株高及粒型的功 能。
[0022] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下：
[0023]-、突變體osnaprtl的分離和遺傳分析：
[0024] 本發(fā)明的同時(shí)影響水稻葉片衰老、株高及粒型的突變體osnaprtl來(lái)自粳稻品種 日本晴（Nipponbare)EMS(ethylmethylsulfone)誘變。通過(guò)與野生型的正反交實(shí)驗(yàn)，證明 該突變體受隱性單基因控制，如圖1所示。
[0025]二、圖位克隆OsNaPRTl:
[0026] l)0sNaPRTl的初步定位：
[0027] 為了分離OsNaPRTl基因，本發(fā)明首先組建了一個(gè)定位群體，由osnaprtl與秈稻品 種臺(tái)中本地1號(hào)雜交配組獲得匕定位群體，再通過(guò)圖位克隆的方法，利用STS、SSR等分子 標(biāo)記對(duì)OsNaPRTl位點(diǎn)進(jìn)行初步定位，將其初步定位在第3染色體上，并介于P1和P2兩個(gè) STS標(biāo)記之間，見(jiàn)圖2。
[0028] 2)0sNaPRTl的精細(xì)定位：
[0029] 通過(guò)對(duì)P1和P2兩個(gè)標(biāo)記之間的BAC序列分析，發(fā)展新的SSR、STS標(biāo)記將OsNaPRT1 精確定位于BAC0SJNBa0042I09上、P4和P5標(biāo)記之間46kb范圍之內(nèi)（圖3)，通過(guò)分析此 區(qū)段開(kāi)放閱讀框（0RF)推測(cè)候選基因。
[0030] 3)OsNaPRTl基因的鑒定和功能分析：
[0031] 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，結(jié)果表明本發(fā)明獲得了使突變體恢復(fù)正常表型的轉(zhuǎn)基因水稻 (圖5、6)，證明了本發(fā)明正確克隆了OsNaPRT1基因（圖7)，氨基酸序列分析表明OsNaPRT1 編碼一個(gè)煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（圖8)。
[0032] 水稻葉片衰老是當(dāng)前水稻高產(chǎn)育種關(guān)注的焦點(diǎn)，能夠通過(guò)調(diào)控水稻葉片衰老的延 遲來(lái)提高生物光合作用合成量而實(shí)現(xiàn)水稻產(chǎn)量的提高，OsNaPRTl基因能同時(shí)影響水稻葉片 衰老、株高及粒型，該基因的克隆和應(yīng)用，對(duì)水稻的增產(chǎn)具有重要意義。綜上所述，本發(fā)明利 用水稻葉片衰老突變體，通過(guò)圖位克隆技術(shù)首次在水稻中克隆到了OsNaPRTl基因，通過(guò)對(duì) OsNaPRTl基因的功能解讀，進(jìn)一步闡明了植物特別是禾本科植物葉片衰老的遺傳機(jī)制及其 作用機(jī)理，為創(chuàng)建水稻新種質(zhì)打下基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0034] 圖1是突變體osnaprtl與野生型材料的表型；
[0035] 圖2是OsNaPRTl基因在水稻第3染色體上的初步定位圖；
[0036] 圖3是OsNaPRTl基因的精細(xì)定位圖；
[0037]圖4是pCAMBIA1300_0sNaPRT 1載體圖譜；
[0038] 圖5是功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)1\轉(zhuǎn)基因水稻植株的表型（左：野生型，右：互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因T1);
[0039] 圖6是轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)代水稻植株與osnaprtl的葉部表型對(duì)比；
[0040] 圖7是OsNaPRTl基因的DNA核苷酸序列（灰色陰影標(biāo)注為編碼560個(gè)氨基酸對(duì) 應(yīng)的核苷酸，即基因的外顯子）；
[0041] 圖8是OsNaPRTl基因編碼的氨基酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 實(shí)施例1:
[0043] 1、水稻材料：
[0044]水稻（Oryza sativa L.)突變體osnaprtl(Oryza sativa nicotinate phosphoribosyltransferase 1)的原始野生型為梗稻品種日本晴（Nipponbare)。
[0045] 水稻（OryzasativaL.)突變體osnaprtl的獲得過(guò)程具體如下：
[0046] 將日本晴種子利用0.7mol/L EMS充分混勻，過(guò)夜處理。第二天用清水將種子表 面沖洗干凈后播種。待凡代植株結(jié)實(shí)后，單株收種，于第二年播種成苗后，在大田中篩選 到一例苗期葉尖過(guò)早枯萎、株高變矮及粒型變小的材料。該材料經(jīng)多代自交種植，性狀 能穩(wěn)定遺傳。因此，將這種同時(shí)表現(xiàn)出"葉尖枯萎、植株變矮及粒型變小"的材料命名為 osnaprtl (Oryza sativa nicotinate phosphoribosyltransferase 1)〇
[0047] 將突變體osnaprtl與野生型進(jìn)行正反交，S卩以突變體osnaprtl為母本，日本晴為 父本進(jìn)行雜交；同時(shí)以日本晴為母本，osnaprtl為父本進(jìn)行雜交。正反雜交Fi代植株均表 現(xiàn)出正常的類(lèi)似日本晴的表型，說(shuō)明該性狀受隱性基因控制。正反雜交的匕代植株自交獲 得的F2群體中，表現(xiàn)出日本晴表型的單株與表現(xiàn)出osnaprtl表型的單株遺傳分離比符合 3:1，說(shuō)明該性狀受單基因控制。由以上分析可