一種昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體的人工表達系統(tǒng)及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體的人工表達系統(tǒng)及其應用。
【背景技術】
[0002]煙堿型乙酰膽堿受體是位于細胞膜上的重要功能性蛋白，屬于半胱氨酸環(huán)配體門控離子通道超家族。在神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)與肌肉連接處介導快速膽堿能。乙酰膽堿受體是跨膜蛋白復合體，由五個亞基組成，分布在細胞表面，這五個亞基環(huán)形排列形成一個中央離子通道。每個亞基含有4個跨膜片斷，分別為M1-M4，其中M1、M3和M4為β折疊，M2為中間帶有一個彎曲的α螺旋，5個亞基的M2形成孔道的內(nèi)襯。它們就像一個分子開關，當與乙酰膽堿等激動劑結合后構象發(fā)生改變，通道就會打開允許離子進出細胞，產(chǎn)生細胞電勢變化和電流變化，這些信號及變化可以通過電生理技術進行檢測和分析。
[0003]煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)作為昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)受體，是新煙堿類、多殺菌素類、沙蠶毒素類等多類殺蟲劑和天然產(chǎn)物煙堿等的作用靶標。目前雖然知道昆蟲中乙酰膽堿受體的亞基類型共有12種分別是α1-α9和β 1-β 3亞基，其體內(nèi)的乙酰膽堿受體由其中的一個或多個亞基構成5聚體，但對于昆蟲內(nèi)源乙酰膽堿受體存在哪些亞型及其具體的化學構成等仍未研宄清楚，成為昆蟲乙酰膽堿受體結構與功能研宄的瓶頸。造成這一難題的主要原因是目前在人工表達系統(tǒng)(如非洲爪蟾卵母細胞及其它各種細胞系)中只表達昆蟲乙酰膽堿受體亞基并不能獲得有功能的體外重組乙酰膽堿受體。目前，只能通過表達昆蟲的乙酰膽堿受體亞基(通常為α亞基)和哺乳動物的乙酰膽堿受體亞基(通常為β亞基)組成乙酰膽堿受體雜合體或構建昆蟲亞基嵌合體的方式才能在人工系統(tǒng)中成功表達出有功能的含有昆蟲亞基的乙酰膽堿受體。但是，用這種方法表達出的所謂的“昆蟲乙酰膽堿受體”包含了哺乳動物乙酰膽堿受體亞基或部分非昆蟲亞基序列，利用這種表達體系而獲得的活性化合物的分析與蛋白功能與特性的研宄結果，不能完全反應真正的昆蟲乙酰膽堿受體的功能及活性化合物的特性。
[0004]T-complex protein I (TCPl)蛋白復合體也被稱為 cytosolic chaperonincontaining TCP-1 (CCT)或 TCPl ring complex (TRiC)是由 α-θ 共 8 個亞基構成的 8 亞基蛋白復合體。TCPl具有分子伴侶功能，能夠輔助其它蛋白實現(xiàn)正確折疊和組裝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體的人工表達系統(tǒng)。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供一種昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體的制備方法。
[0007]本發(fā)明的又一目的是提供該昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體的應用。
[0008]本發(fā)明的目的可通過以下技術方案實現(xiàn):
[0009]一種昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體的人工表達系統(tǒng)，所述的人工表達系統(tǒng)中除表達昆蟲乙酰膽堿受體外還表達了 TCPl蛋白復合體。
[0010]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的昆蟲乙酰膽堿受體選自乙酰膽堿受體亞基中的兩個或多個亞基，進一步優(yōu)選至少包含昆蟲乙酰膽堿受體的一個α亞基和一個β亞基；所述的α亞基和β亞基可以來自同一昆蟲也可以來自不同的昆蟲。
[0011 ] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選，所述的TCPl蛋白復合體與乙酰膽堿受體來自同一種昆蟲，或者來源于不同的昆蟲或非昆蟲。
[0012]作為本發(fā)明的進一步優(yōu)選，所述的人工表達系統(tǒng)除表達乙酰膽堿受體外，只表達TCPl蛋白復合體。
[0013]作為本發(fā)明的進一步優(yōu)選，所述的人工表達系統(tǒng)除表達乙酰膽堿受體和TCPl蛋白復合體外，還共同表達有增強乙酰膽堿受體蛋白復合體功能的其它蛋白和/或蛋白復合體。
[0014]作為本發(fā)明的進一步優(yōu)選，所述的人工表達系統(tǒng)除表達乙酰膽堿受體、TCPl蛋白復合體和有增強乙酰膽堿受體功能的蛋白和/或蛋白復合體外，還共同表達其它蛋白和/或蛋白復合體。
[0015]作為本發(fā)明的進一步優(yōu)選，所述的人工表達系統(tǒng)包括但不限于非洲爪蟾卵母細胞表達系統(tǒng)。
[0016]一種人工表達昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體的制備方法，包括以下步驟:
[0017](I)克隆乙酰膽堿受體和TCPl的基因并構建重組質(zhì)粒；
[0018](2)根據(jù)所選用的人工表達系統(tǒng)不同，直接使用所述的重組質(zhì)粒，或?qū)⑺龅闹亟M質(zhì)粒進行體外轉(zhuǎn)錄獲得目的基因的cRNA，或?qū)⑺龅闹亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)染用的病毒獲得重組病毒；
[0019](3)依據(jù)所選用的人工表達系統(tǒng)不同，將所述的重組質(zhì)?；騝RNA或含有目的重組質(zhì)粒的病毒通過適用于該人工表達系統(tǒng)的方法將上述質(zhì)粒或cRNA或重組病毒轉(zhuǎn)入到表達系統(tǒng)中；
[0020](4)依據(jù)所用表達系統(tǒng)不同，培養(yǎng)適當?shù)臅r間后，即可表達獲得有功能的乙酰膽堿受體。
[0021]本發(fā)明所述的人工表達系統(tǒng)在檢測、分析、篩選具有乙酰膽堿受體激動劑/拮抗劑活性的化合物中的應用。
[0022]一種檢測、分析具有乙酰膽堿受體激動劑/拮抗劑活性的化合物的方法，包括以下步驟:將利用本發(fā)明所述的人工表達系統(tǒng)表達的昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體與待檢測、分析的化合物相接觸、反應，檢測昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體發(fā)出和/或?qū)е碌男盘柤靶盘栕兓?，從而推斷化合物是否具備乙酰膽堿受體激動劑/拮抗劑活性。
[0023]一種篩選具乙酰膽堿受體激動劑/拮抗劑活性的化合物的方法，其特征在于將待檢測、分析的化合物與利用本發(fā)明所述的人工表達系統(tǒng)表達的昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體相接觸、反應，檢測昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體發(fā)出和/或?qū)е碌男盘柤靶盘栕兓?，能夠使昆蟲乙酰膽堿受體蛋白復合體發(fā)出信號的為具有乙酰膽堿受體激動劑/拮抗劑活性的化合物；根據(jù)信號的強弱能夠判斷其活性的大小。
[0024]有益效果:
[0025]本發(fā)明與現(xiàn)有的在人工表達系統(tǒng)中表達昆蟲乙酰膽堿受體的方法相比，其優(yōu)點和積極效果表現(xiàn)為:
[0026]1、精確度高。目前如果要表達有功能的昆蟲乙酰膽堿受體，只能通過昆蟲乙酰膽堿受體的亞基與哺乳動物乙酰膽堿受體β亞基共表達或構建昆蟲乙酰膽堿受體亞基的嵌合體(即亞基核酸序列中只有一部分序列是昆蟲乙酰膽堿受體亞基的序列)來實現(xiàn)。而本發(fā)明提供的方法擺脫了上述的技術限制，能夠?qū)崿F(xiàn)全昆蟲亞基乙酰膽堿受體在人工表達系統(tǒng)中表達獲得有功能的重組受體，因為不包含哺乳動物的亞基或非乙酰膽堿受體序列，所以能夠更加精確的反映昆蟲乙酰膽堿受體的真實特性，為農(nóng)藥等的開發(fā)提供了更好的檢測和篩選平臺。
[0027]2、準確性高。如I中所述，目前所用的昆蟲乙酰膽堿受體表達方法并不能表達昆蟲乙酰膽堿受體的β亞基。本發(fā)明提供的方法可實現(xiàn)昆蟲乙酰膽堿受體α亞基與β亞基共同表達獲得有功能的受體，獲得的重組受體更接近昆蟲體內(nèi)受體組成的真實情況，應用于農(nóng)藥等活性化合物的開發(fā)和研宄所獲得的數(shù)據(jù)更加準確可靠，有利于以乙酰膽堿受體為靶標的活性藥物開發(fā)與篩選模型的建立等。
[0028]3、特異性好。與使用活體昆蟲進行生測相比，使用人工表達系統(tǒng)表達獲得的有功能的乙酰膽堿受體進行農(nóng)藥等活性化合物的檢測排除了昆蟲體壁藥劑穿透過程和昆蟲體內(nèi)解毒代謝等過程的影響，能夠簡單直接的反映出以乙酰膽堿受體為靶標的農(nóng)藥等活性化合物的特性，具有很強的特異性，有益于農(nóng)藥等的檢測和篩選。
【附圖說明】
[0029]圖1.非洲爪蟾卵母細胞中表達的昆蟲乙酰膽堿受體受到乙酰膽堿刺激后用電壓鉗檢測到的電流變化。
[0030]其中(a)為對照實驗1.即目前使用的昆蟲乙酰膽堿受體表達方法，用東亞飛蝗乙酰膽堿受體的α I亞基(Loc α I)和大鼠的β 2亞基(r β 2)共同表達，乙酰膽堿刺激后產(chǎn)生乙酰膽堿受體的特征電流；(b)對照實驗2僅用東亞飛蝗乙酰膽堿受體的a ULoca I)亞基和f3 1(Locf3 1)亞基不能表達獲得有功能的乙酰膽堿受體，表現(xiàn)為乙酰膽堿刺激后沒有電流產(chǎn)生；對照實驗3僅表達TCPl并受到乙酰膽堿刺激后也沒有電流產(chǎn)生；(C)為同時表達Loc a I亞基、Loc β I亞基和TCPl，受到乙酰膽堿刺激后產(chǎn)生電流，并且電流可以被DHf3 E (二氫-β -刺桐啶堿)抑制，當去除DHf3 E后，乙酰膽堿刺激電流能夠恢復，這表明在非洲爪蟾卵母細胞中同時表達Loc a I亞基、Loc β I亞基和TCPl獲得了有功能的乙酰膽堿受體。
【具體實施方式】
[0031]實施例1
[0032]1.本實施例以東亞飛蝗為乙酰膽堿受體和TCPl的來源，以非洲爪蟾卵母細胞為人工表達系統(tǒng)表達乙酰膽堿受體a I亞基和β I亞基以及TCPl來說明【具體實施方式】，但本方法并不局限于本例所述的材料和表達系統(tǒng)。同時，使用非洲爪蟾卵母細胞人工表達系統(tǒng)進行了對照實驗。對照實驗I為目前使用的昆蟲乙酰膽堿受體表達方法，具體為只表達東亞飛蝗乙酰膽堿受體的a I亞基(Loc a I)和大鼠的β 2亞基(r β 2);對照實驗2為只表達東亞飛蝗乙酰膽堿受體的α I亞基和β I亞基，對照實驗3只表達TCPl蛋白復合體(α-θ亞基)，對照實驗并非本方法必須的實驗，此處是為了證明本方法真實有效。目的基因的克隆和質(zhì)粒構建
[0033](I)分別取東亞飛蝗腦和腹神經(jīng)索等神經(jīng)組織約10mg以及大鼠腦組織lOOmg，用TRIzol法提取總RNA，分別以提取的總RNA為模板合成cDN