一種浴場(chǎng)海水中致病性細(xì)菌的基因芯片檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種浴場(chǎng)海水中致病性細(xì)菌的基因芯片檢測(cè) 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 夏秋時(shí)節(jié)旅游旺季海濱浴場(chǎng)承受著超負(fù)荷的壓力，給浴場(chǎng)水質(zhì)帶來了嚴(yán)重的影 響，同時(shí)也增加了病原微生物的傳播機(jī)會(huì)。細(xì)菌是引發(fā)感染性疾病的主要病原體，在抗生素 濫用的選擇壓力下，海洋環(huán)境中出現(xiàn)了大量的耐藥細(xì)菌，給人類健康帶來了潛在且無法估 計(jì)的新威脅，因此，多種致病性細(xì)菌的同時(shí)、快速、靈敏、特異的診斷是有效預(yù)防感染性疾病 發(fā)生，控制其暴發(fā)性傳播的前提和關(guān)鍵。雖然PCR及其衍生技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)致病性細(xì)菌的快 速、靈敏診斷，但是一次只能同時(shí)檢測(cè)一種致病性細(xì)菌，與之相比，基因芯片技術(shù)具有高通 量、平行性、微型化、自動(dòng)化等顯著優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)的出現(xiàn)為致病性細(xì)菌的分子診斷提供了有 力的技術(shù)支撐。
[0003]目前國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都已經(jīng)將基因芯片技術(shù)應(yīng)用到臨床以及食品安全等多個(gè)研 宄領(lǐng)域。我國(guó)自1997年開始了解生物芯片技術(shù)，1998年正式進(jìn)入芯片研宄，現(xiàn)全國(guó)已有20 多家科研機(jī)構(gòu)和公司從事生物芯片的研發(fā)。目前與致病性細(xì)菌檢測(cè)相關(guān)的基因芯片研宄獲 得長(zhǎng)足進(jìn)展，已申請(qǐng)的專利包括"食源性致病菌快速檢測(cè)基因芯片及其應(yīng)用"、"炭疽菌診斷 基因芯片的制備及應(yīng)用"、"泌尿生殖道炎癥病原體和耐藥性集成診斷基因芯片及方法"等 上百種。然而由于海水中雜質(zhì)較多、致病性細(xì)菌種類繁多，且檢測(cè)靶位易突變，給該方法的 應(yīng)用帶來一系列困難，造成該方法尚未在海洋環(huán)境檢測(cè)領(lǐng)域得以應(yīng)用。
[0004] 目前，基因芯片對(duì)應(yīng)的探針靶定區(qū)域通常選擇致病性細(xì)菌的16SrDNA序列、23S rRNA序列和16SrRNA-23SrRNA基因。16SrDNA序列因具有高度保守性，已成為細(xì)菌種屬鑒 定最常用的序列，但由于其高度保守性，因而不能很好的鑒別相近種或同一種內(nèi)的不同菌 株；而23SrRNA序列目前被報(bào)道的比較少，我們常常無法獲取需要的序列；16SrRNA-23Sr RNA基因區(qū)間由于其可用于鑒別相近種，或同一種內(nèi)的差異，而被廣泛應(yīng)用，但對(duì)于只有一 個(gè)或兩個(gè)操縱子拷貝的細(xì)菌而言，不能利用16SrRNA-23SrRNA的基因區(qū)間序列進(jìn)行探針 的設(shè)計(jì)，因此，為保證其特異性，需要選擇合適的特異性的靶基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
[0005]目前基因芯片對(duì)應(yīng)的探針種類主要有兩種，一種是進(jìn)行氨基修飾的長(zhǎng)度在 20-40mer的探針，另一種是不進(jìn)行氨基修飾的60-70mer的探針。以往的研宄多采用的是短 探針。短探針可用來檢測(cè)單個(gè)堿基的不同，提高檢測(cè)的特異性，需點(diǎn)制在醛基基片上；而長(zhǎng) 探針不需要檢測(cè)到單個(gè)堿基的差異，當(dāng)考慮到不同個(gè)體之間的核酸堿基多態(tài)性時(shí)，可選擇 設(shè)計(jì)此類探針，該類探針需點(diǎn)制在氨基基片上。與短探針相比，長(zhǎng)探針具有更好的特異性和 均一的退火溫度（Tm值），被證明在靈敏度和特異度兩方面表現(xiàn)更佳，此外還能兼顧信號(hào)強(qiáng) 度，但是以往的研宄多采用短探針。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明以浴場(chǎng)海水中對(duì)人類危害較大的6種致病性細(xì)菌為研宄對(duì)象，旨在建立浴 場(chǎng)海水致病性細(xì)菌的基因芯片檢測(cè)方法，科學(xué)合理的確定其反應(yīng)條件的最優(yōu)化，并克服海 水環(huán)境復(fù)雜的缺點(diǎn)，保證檢測(cè)的特異性。建立其基因芯片的檢測(cè)方法。本發(fā)明所采用的技 術(shù)方案是：
[0007] -種浴場(chǎng)海水中致病性細(xì)菌的基因芯片檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法的步驟為：
[0008] 第一步：致病性細(xì)菌及其靶基因的確定。根據(jù)國(guó)內(nèi)外大量的文獻(xiàn)報(bào)道以及本研宄 前期大量的調(diào)查研宄為基礎(chǔ)，確立了浴場(chǎng)海水中常見的、對(duì)人類危害較大的6種致病性細(xì) 菌，分別為嗜水氣單胞菌、大腸桿菌〇157:H7、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌、溶藻弧菌、金黃 色葡萄球菌。
[0009] 根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)確定上述各菌株的特異性靶基因。其特異性靶基因分別為： 嗜水氣單胞菌（A.hydrophila)的Ahal基因、大腸桿菌0157 :H7 (E.coli0157:H7)的 hlyA、fliC、rfbE基因、腸炎沙門氏菌（Salmonella)的invA和hilA基因、單增李斯特菌 (L.monocytogenes)的pic和hlyA基因、溶藻弧菌（V.alginolyticus)的hsp60 基因、金黃 色葡萄球菌（S.aureus)的tuf基因。
[0010] 第二步：6種浴場(chǎng)致病性細(xì)菌70-mer寡核苷酸探針及引物的設(shè)計(jì)。應(yīng)用AllelelD 6. 0軟件設(shè)計(jì)特異基因的引物及寡核苷酸探針，并應(yīng)用DNASTAR軟件對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。引物和 探針信息如表1和表2所示。
[0011] 表1各致病性細(xì)菌的引物序列及其Tm值
[0013]
[0014] 表2各致病性細(xì)菌的探針序列及其Tm值

[0017] 第三步：焚光標(biāo)記PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增采用20yL反應(yīng)體系，
[0018] 1〇xPCR緩沖液(AMgCI2) 2.0(jL dNTPs(10mmol/L) 0.4|jL 上下游引物(10pmol/pL) ^ 0.5 |jL TaqDNA聚合酶（5U/mL) 0.2mL DNA模板 1|JL ddH20 15.4 mL
[0019] 1)取5 y L PCR產(chǎn)物至無菌潔凈的0. 2mL離心管中，作為模板；
[0020] 2)向每個(gè)樣品管加入一定濃度的帶有熒光素Cy3標(biāo)記的隨機(jī)引物（9N)溶液 3yL，并補(bǔ)水至19yL，震蕩混勻，瞬時(shí)離心。在最佳探針濃度和最佳基因組濃度條件下， 進(jìn)行Cy3-隨機(jī)引物濃度的確定，當(dāng)Cy3-隨機(jī)引物濃度為0. 375yM時(shí)，能產(chǎn)生肉眼可見的 熒光。而當(dāng)Cy3-隨機(jī)引物濃度為0. 190yM時(shí)，熒光度值< 1000,產(chǎn)生的熒光極弱，說明 Cy3-隨機(jī)引物的最低濃度至少可達(dá)到0. 375yM，為確保能產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號(hào)，本實(shí)驗(yàn)過 程中采用的Cy3-隨機(jī)引物濃度為0. 75yM;
[0021] 3)將離心后的樣品管放入PCR儀，95°C變性3min，立即放置冰上3min;
[0022] 4)在冰上制備焚光標(biāo)記反應(yīng)體系Mix:5XKlenowBuffer2. 5uL，klenow酶 1yL,dNTP(2. 5mM)2. 5yL；
[0023] 5)將步驟3)樣品管瞬時(shí)離心，并向各管中加入6yL熒光標(biāo)記反應(yīng)體系Mix，震蕩 混勻，瞬時(shí)離心；
[0024] 6)將離心管放入PCR儀，進(jìn)行熒光標(biāo)記擴(kuò)增，熒光標(biāo)記反應(yīng)程序?yàn)椋?7°C1.5h， 70°C10min〇
[0025] 7)程序結(jié)束后，將樣品置于冰上，然后進(jìn)行芯片雜交。為確定最佳的紫外交聯(lián)時(shí) 間，在紫外照射能量為2400mJ條件下，分別照射0. 5h、lh、2h、3h、4h、5h、6h，紫外交聯(lián)lh時(shí)， 即可產(chǎn)生肉眼可見的熒光信號(hào)，熒光信號(hào)值為5808,而交聯(lián)0.5h時(shí)，熒光值為< 1000。因 此確定當(dāng)紫外照射能量為2400mJ時(shí)，最低紫外交聯(lián)時(shí)間為lh，為確保實(shí)驗(yàn)的能產(chǎn)生穩(wěn)定熒 光信號(hào)，本實(shí)驗(yàn)采用的紫外交聯(lián)時(shí)間為2h;
[0026] 第四步：制備基因芯片。采用噴點(diǎn)式芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)點(diǎn)樣儀，以及Nano-tip A070-401點(diǎn)樣針進(jìn)行點(diǎn)樣。將一定濃度的探針與點(diǎn)樣液等體積混合，然后用移液槍將其混 合物加入384孔板，按照設(shè)定好的參數(shù)將探針點(diǎn)到氨基化玻片上，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)三次。點(diǎn)樣 時(shí)要注意保持濕度為70%，點(diǎn)樣時(shí)除放芯片之外，還要放一張感應(yīng)試紙（用于觀察點(diǎn)樣效 果）。點(diǎn)樣完畢后，將點(diǎn)好的芯片取出，關(guān)閉儀器。將點(diǎn)制好的芯片放入紫外燈下交聯(lián)一定 的時(shí)間，然后用0.5%的SDS沖洗2min，用離心機(jī)甩干后，放入4°C冰箱避光保存?zhèn)溆?。?過設(shè)置探針濃度梯度，發(fā)現(xiàn)探針濃度為1UM到16yM都可以檢測(cè)到熒光信號(hào)，而探針濃度 為0. 5yM時(shí)，熒光度值< 500,熒光信號(hào)很微弱，因此我們確定探針的最小終濃度為1yM， 為確保實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)合理且順利進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中我們采用能產(chǎn)生較強(qiáng)穩(wěn)定熒光信號(hào)的探針 濃度2yM;
[0027] 第五步：雜交。將雜交buffer放到50°C水浴鍋中預(yù)熱，然后配置20yL的雜交液：
[0028] 4X雜交緩沖液 5yL
[0029] 焚光標(biāo)記產(chǎn)物15 yL
[0030] 雜交液配好后，95°C變性3min，立即放置冰上，然后放入沸水中煮沸2min后，立即 放入預(yù)冷的無水乙醇中l(wèi)min，用低速離心機(jī)將芯片甩干。然后將該芯片對(duì)應(yīng)的感應(yīng)試紙放 于芯片下面，按照感應(yīng)試紙上矩陣的排列方式。避光條件下，用移液槍取15yL的熒光標(biāo)記 產(chǎn)物和5yL的陽控混合均勻后加入芯片點(diǎn)樣區(qū)，然后蓋上蓋玻片，然后將此芯片放入65°C 水浴鍋中水浴2h或過夜；
[0031] 第六步：芯片清洗及掃描。取出上一步的芯片，用自來水沖洗半分鐘，再用蒸餾 水沖洗一次，然后分別用42°C預(yù)熱過的洗液I、II、III分別洗脫2min，洗液I是用10mL20XSSC(175. 3g氯化鈉，88. 2g檸檬酸鈉，加蒸餾水定容至1000mL，pH為7. 0)和4mL 10XSDS(10g二十烷基磺酸鈉加入雙蒸水100mL制成）加入186mL蒸餾水混勻制成；洗液 II是用2mL20XSSC加入198mL蒸餾水混勻制成；洗液III是用lmL20XSSC加入199mL蒸 餾水混勻制成，然后將芯片離心甩干。用生物芯片掃描儀掃描芯片，并輸出熒光值，然后用 軟件分析所得數(shù)據(jù)。
[0032] 本發(fā)明的探針分別根據(jù)嗜水氣單胞菌的Ahal基因、大腸桿菌0157 :H7的hlyA、 fliC、rfbE基因、腸炎沙門氏菌的invA、hilA基因、單增李斯特菌的plc、hlyA基因、溶藻弧 菌的hsp60基因和金黃色葡萄球菌tuf基因而設(shè)計(jì)的特異性的探針，每種致病性細(xì)菌設(shè)計(jì) 了 1-3條探針，其長(zhǎng)度約為70-mer。
[0033] 鑒于現(xiàn)有探針技術(shù)存在的問題，在探針設(shè)計(jì)時(shí)采取了兩種措施：一、為保證物種的 特異性，每