一種快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP的診斷方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病原微生物的檢測(cè)，具體涉及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(LAMP技術(shù))快速檢測(cè)細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，隨著亞胺培南等碳青酶烯類抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌產(chǎn)生了一類能廣泛水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的金屬β-內(nèi)酰胺酶，產(chǎn)該類酶的細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類所有抗生素產(chǎn)生耐藥性，給臨床抗感染治療造成極大困難，而且目前產(chǎn)金屬內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌種類和數(shù)量在不斷增加，已報(bào)道的主要有/#產(chǎn)和KJ#兩種類型。而在廣東廣州，2005?2007年多家醫(yī)院曾出現(xiàn)產(chǎn)MP金屬酶銅綠假單胞菌的爆發(fā)流行，己成為臨床醫(yī)師面臨的棘手問(wèn)題。因此，及時(shí)有效的監(jiān)控由/#/丐丨起的耐亞胺培南銅綠假單胞菌醫(yī)院感染勢(shì)在必行。
[0003]而傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法和藥敏試驗(yàn)法能在臨床上提供較好的價(jià)值，但因耗時(shí)長(zhǎng)、繁瑣的操作過(guò)程、需要昂貴的儀器設(shè)備等不同的原因未能在臨床上大規(guī)模推廣使用。而本研宄針對(duì)MP設(shè)計(jì)的特異性擴(kuò)增引物不單可以有效特異地?cái)U(kuò)增/#產(chǎn)，從而建立起一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP試劑盒、以及一種用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(LAMP技術(shù))快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMPmm。
[0005]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP引物組，其包括一對(duì)內(nèi)引物、一對(duì)外引物和一對(duì)環(huán)引物，核苷酸序列分別如下所示:
內(nèi)引物 1:5，_ TTAGCTTGTACCTTACCGTCTTAGAGTGGCTTAATTCTCAATCT-3，(SEQ ID N0.1)；內(nèi)引物 2:5’ - GCGGAGTTAGCTATTGGCTAGTCCACTACGTTATCTGGAGC-3，(SEQ ID N0.2)；外引物 1:5，- TTCCATAGCGACAGCACG -3，(SEQ ID N0.3)；
外引物 2:5，- ATTACCTAGACCGTAGGGTTT -3，(SEQ ID N0.4)；
環(huán)引物 1:5’ - GTTAATTCAGATGCATACGTGG-3’ (SEQ ID N0.5)；
環(huán)引物 2:5，- TATCCTGGTCCAGGGCAC -3，(SEQ ID N0.6)。
[0006]一種用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/猶LAMP試劑盒，其包括上述用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP引物組。
[0007]作為優(yōu)選的，所述引物組中，內(nèi)引物、外引物、環(huán)引物的摩爾比為6-8:1:3_4。
[0008]作為優(yōu)選的，所述試劑盒中還含有:DNA聚合酶，LAMP反應(yīng)液，顯色劑，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0009]作為優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶。
[0010]作為優(yōu)選的，所述LAMP反應(yīng)液含有:10 mM dNTP, 10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgSCVK溶液、5 mM甜菜堿，四者的體積比為6-8:4-5:2-3:8_10。
[0011]作為優(yōu)選的，所述顯色劑為SYBR GREEN I。
[0012]作為優(yōu)選的，所述陽(yáng)性對(duì)照為含有細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/竹段的質(zhì)粒，所述細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/竹段如SEQ ID N0.7所示；所述陰性對(duì)照為DEPC 水。
[0013]一種快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺方法，包括如下步驟:
(1)提取待檢樣品DNA；
(2)利用上述用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/?勺LAMP引物組對(duì)待檢樣品DNA進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；
(3)結(jié)果判斷:在上述反應(yīng)管中加入1_2μ?顯色劑10XSYBRGREEN I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為/#產(chǎn)金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因，橙色則為非/#/?因。
[0014]作為優(yōu)選的，等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)的25 μ L反應(yīng)體系含有:內(nèi)引物各8pmol/>L，外引物各I pmol/^L，環(huán)引物各4 pmol/^L，反應(yīng)液12.5μ?，DNA聚合酶8U，待檢DNA 1-100 ng,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μ? ;等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:60-65°C反應(yīng)55_65min。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:發(fā)明針對(duì)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因TMc特異性設(shè)計(jì)了 6條引物，與目的基因的6個(gè)區(qū)域結(jié)合，具有較高的特異性，能準(zhǔn)確地將細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/7與其他非細(xì)菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/3區(qū)分開(kāi)來(lái)。另外，本發(fā)明的試劑盒方便快捷，能在較短的時(shí)間內(nèi)鑒別細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#產(chǎn)，不需要昂貴的儀器設(shè)備；靈敏度高；特異性好，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明對(duì)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP以及對(duì)非細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因頂P的擴(kuò)增結(jié)果(一:陰性樣品，+:細(xì)菌金屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因頂P樣本)；
圖 2 為實(shí)施例 3 的特異性驗(yàn)證結(jié)果(l:DEPC，2:C7Z-#-l，3:/?E；4: SMB, 5: CMY-2,6: TEM, 7:1MP, 8: VIM and CMY-2)；
圖3為實(shí)施例4的LAMP靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(a::本發(fā)明LAMP擴(kuò)增的電泳結(jié)果；b:本發(fā)明LAMP擴(kuò)增的顯色結(jié)果；其中，I為DEPC，2?9為含有細(xì)菌屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP的 pBCSK 質(zhì)粒，濃度依次為 1.0XlO0、1.0XlO1U.0Χ102、1.0Χ103、1.0Χ104、1.0X 105、1.0Χ106、1.0X 17 拷貝 /yL)o
[0017]圖4為實(shí)施例4的常規(guī)PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(其中，I為DEPC，2?9含有細(xì)菌屬β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因/#/猶PBCSK質(zhì)粒，濃度依次為1.0X10° U-OXlO1U.0XlO2,1.0Χ103、1.0Χ104、1.0Χ105、1.0Χ106、1.0 X 17 拷貝 /yL)o
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0019]實(shí)施例1用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP的LAMP試劑盒的建立
用于快速檢測(cè)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因IMP的LAMP試劑盒，包括以下成分:
(I)特異性引物組；(2) DNA聚合酶；(3) LAMP反應(yīng)液；(4)顯色劑；(5)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0020]( I)特異性引物的設(shè)計(jì):
根據(jù)細(xì)菌金屬β -內(nèi)酰胺酶耐藥基因頂P (GenBank登錄號(hào)為:(NF812058)的特異性設(shè)計(jì)6條特異性引物，序列分別如下:
內(nèi)引物 1:5，_ TTAGCTTGTACCTTACCGTCTTAGAGTGGCTTAATTCTCAATCT-3，(SEQ ID N0.1)；內(nèi)引物 2:5’ - GCGGAGTTAGCTATTGGCTAGTCCACTACGTTATCTGGAGC-3，(SEQ ID N0.2)；外引物 1:5，- TTCCATAGCGACAGCACG -3，(SEQ I