亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥試劑領(lǐng)域，尤其涉及基因診斷試劑盒，具體是指一種亞甲基四氫 葉酸還原酶基因多態(tài)性檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 亞甲基四氫葉酸還原酶基因（MTHFR)是一碳單位代謝酶，存在于動(dòng)物肝臟。是葉 酸甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其主要作用是可將5, 10-四氫甲基葉酸還原為5-甲基四氫葉 酸，為同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化為蛋氨酸提供甲基，并且是DNA、以一碳單位的形式參與嘌呤和嘧 啶的合成，并為DNA、RNA和蛋白質(zhì)甲基化提供甲基，影響DNA代謝。
[0003] 蛋白質(zhì)和神經(jīng)傳遞因子等多種生物基質(zhì)的甲基供體。甲硫氨酸為人體內(nèi)的必需氨 基酸，甲硫氨酸合成受阻使蛋白質(zhì)合成異常。作為甲基供體參與甲硫氨酸代謝，從而維持血 漿同型半胱氨酸（Hey)正常水平，Hey代謝途徑如圖1。MTHFR677C-T突變突變后，其生物 活性?xún)H有正常酶活性的50%，并且其與血漿同型半胱氨酸升高有關(guān)。MTHFRC677T突變位 點(diǎn)是目前發(fā)現(xiàn)的MTHFR基因最常見(jiàn)的不耐熱錯(cuò)義突變，研宄表明該突變導(dǎo)致MTHFR酶活性 下降使Hey甲基化障礙，導(dǎo)致Hey水平升高。
[0004] 1、MTHFR與相關(guān)疾病
[0005] 1. 1MTHFR與心血管疾病
[0006] 高同型半胱氨酸血癥是心血管疾病危險(xiǎn)因子。MTHFR是Hey代謝的關(guān)鍵酶，該基因 C677T在Hey代謝途徑是最為常見(jiàn)的突變類(lèi)型。C-T的突變使其活性和耐熱性降低而引 起Hey血中水平升高，血漿Hey水平升高可直接或間接的損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使得ET-1合 成增加，N0及PGI2分泌減少，破壞血管舒、縮因子的平衡。搞Hey還可刺激血管平滑肌細(xì) 胞增殖，降低血管壁的順應(yīng)性，致血管壁彈性降低。因此Hey水平的升高參與了心血管的病 理生理過(guò)程。
[0007]MTHFR677C-T突變致心血管病的機(jī)理如下：1.內(nèi)皮毒性的作用：MTHFR 677C-T突變導(dǎo)致Hey在體內(nèi)水平升到，可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，破壞血管壁彈力層和膠原纖 維致血管彈性下降。機(jī)理可能是：a.Hey在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自氧化，產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié) 構(gòu)破壞和功能的改變；b.Hey降低細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的水平，消弱了其阻止N0氧 化失活的作用，增強(qiáng)了脂質(zhì)過(guò)氧化物與過(guò)氧化氫對(duì)細(xì)胞損傷效應(yīng)；c.改變內(nèi)皮細(xì)胞基因表 達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.刺激血管平滑肌細(xì)胞增生：Hey促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，血管順應(yīng) 性下降，促進(jìn)動(dòng)脈硬化的形成。3.對(duì)凝血功能的影響：Hey改變凝血因子含量和活性促進(jìn)血 栓形成。Hey促進(jìn)apoB自由胺基和LDL巰基化使LDL密度增加，Hey還參與炎癥反應(yīng)與免 疫反應(yīng)，影響細(xì)胞發(fā)育和分化。
[0008] 1. 2MTHFR與非綜合征性唇腭裂
[0009] 非綜合征性唇腭裂是指不伴有任何其他發(fā)育畸形的唇腭裂，占所有唇腭裂發(fā)病 數(shù)量的70%。非綜合征性唇腭裂在各種族的發(fā)病率有所不同，亞洲黃種人及美洲印第 安人群中最高，白種人次之，黑人發(fā)病率最低。在我國(guó)，非綜合征性唇腭裂發(fā)病率大約為 1. 42/1000。葉酸是頒面部發(fā)育的必要因素，而MTHFR突變后可導(dǎo)致葉酸代謝過(guò)程中亞甲基 四氫葉酸還原酶功能的缺失使得葉酸濃度下降，從而增加胎兒罹患非綜合征性唇腭裂的概 率。
[0010] 1. 3MTHFR與男性不育
[0011] Hey具有細(xì)胞毒性，可以使巰基氧化，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致精子線(xiàn)粒體 和核DNA損傷，最終引起精子功能受損。同時(shí)有研宄認(rèn)為Hey可抑制谷胱甘肽合成，破壞精 液中活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡，影響精子功能。另有研宄表明，高Hey血癥可引起睪丸 中的血管過(guò)早發(fā)生動(dòng)脈硬化，影響睪丸的血液供應(yīng)，導(dǎo)致生精功能障礙。葉酸是一種抗氧化 劑，當(dāng)體內(nèi)呈高Hey水平時(shí)，如果攝入葉酸減少，體內(nèi)無(wú)足夠的葉酸來(lái)抵制高Hey產(chǎn)生的氧 化應(yīng)激，可致精子DNA受損，影響生育功能。
[0012] 1.4MTHFR與復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)、早產(chǎn)
[0013] 早產(chǎn)是常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥，占分娩總數(shù)的5%~15%。約有15%的早產(chǎn)兒在新生 兒期死亡，占新生兒死亡的70%以上。存活的早產(chǎn)兒中10%~30%留有遠(yuǎn)期的智力發(fā)育障 礙或神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥。MTHFR突變會(huì)使Hey代謝受阻，在體內(nèi)積聚引起高同型半管氨酸血 癥。高同型半管氨酸血癥與多發(fā)性流產(chǎn)、子癇前期、胎盤(pán)早剝、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒畸形、死 胎有關(guān)，且與早產(chǎn)密切相關(guān)。在影響Hey代謝的關(guān)鍵酶中，MTHFR最為受到研宄重視。這是 由于MTHFR存在基因突變會(huì)降低酶的活性，是造成Hey濃度升高的重要遺傳因素。
[0014] 導(dǎo)致復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)發(fā)生的機(jī)制有以下兩個(gè)方面：1.妊娠期孕婦血液處于高凝 狀態(tài)，胎盤(pán)部位血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)血栓的形成可導(dǎo)致流產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病等病理妊娠，因而凝 血機(jī)制在復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中的作用機(jī)制備受關(guān)注。MTHFR是常見(jiàn)的凝血相關(guān)基因，677位 點(diǎn)的突變使酶活性降低，體內(nèi)Hey水平升高，從而引發(fā)高Hey血癥，引起胎盤(pán)栓塞，導(dǎo)致發(fā)生 復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)。2.MTHFR在葉酸代謝、甲基供體生成和核苷酸重新合成過(guò)程中起重要作 用。葉酸代謝異?？烧T導(dǎo)DNA甲基化的模式發(fā)生畸變，進(jìn)而將可能導(dǎo)致低效的DNA復(fù)制和修 復(fù)。由于突變使得體內(nèi)葉酸缺乏，胎盤(pán)組織中的MTHFR活性下降，引起胎兒生長(zhǎng)發(fā)育必須的 生物成分DNA出現(xiàn)甲基化不足，并且DNA合成和修復(fù)過(guò)程發(fā)生障礙，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)。 MTHFR677CT和TT型孕婦發(fā)生復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的危險(xiǎn)性分別是CC型孕婦的8. 75倍和9. 33 倍。
[0015] 1.5MTHFR與高血壓
[0016] 研宄表明在輕中度高血壓人群中，血漿Hey與葉酸水平存在負(fù)相關(guān)，在血漿Hey轉(zhuǎn) 化為蛋氨酸的途徑中，是以5-甲基四氫葉酸為甲基供體，而5-甲基四氫葉酸又是由葉酸在 體內(nèi)轉(zhuǎn)化而成的，由此，患者體內(nèi)的葉酸水平會(huì)明顯影響著Hey的水平。研宄表明每日服 用葉酸l〇mg-年后，血漿Hey水平明顯下降。而經(jīng)觀察高血壓人群其平均血漿Hey水平 (15ymol/L)要比一般人群血漿Hey水平（10ym〇l/L)要高。高血壓患者是心血管病變的 高危人群，同時(shí)血漿Hey水平明顯高于正常人，而血漿Hey濃度升高，可破壞血管內(nèi)皮，激活 血小板、凝血系統(tǒng)，抑制蛋白C等抗凝血物質(zhì)的活性，導(dǎo)致血栓形成，增加心肌梗死、動(dòng)脈粥 樣硬化、冠心病、心腦血管病變的發(fā)生率。MTHFR677C-T突變后，Hey水平會(huì)顯著增加， MTHFR帶有TT基因型人群中Hey水平高于CT基因型，CT基因型高于CC基因型，說(shuō)明TT基 因型中葉酸水平對(duì)血漿Hey水平的影響最大，如果TT基因型患者中葉酸缺乏，其血漿Hey 水平將最高；同樣，如果TT基因型患者中在治療高血壓的同時(shí)補(bǔ)充葉酸，其血漿Hey的下降 幅度也將最大。一方面高血壓患者中TT基因型者血漿Hey水平顯著高于其他基因型患者， 另一方面，TT基因型患者中，補(bǔ)充葉酸降低血漿Hey水平的幅度高于其他基因型患者。 [0017] 妊娠期高血壓疾?。篗THFR基因677位點(diǎn)的突變使酶活性降低，體內(nèi)Hey水平升 高，當(dāng)Hey水平升高時(shí)，容易被氧化成同型半胱氨酸化合物，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫和超氧離子 自由基，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血管細(xì)胞增殖，由于內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于較高水平的Hey 中，導(dǎo)致細(xì)胞釋放一氧化氮產(chǎn)物減少，內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的抑制作用減弱，血小板黏附聚集，而 且Hey晶體可以為血管內(nèi)凝血因子的接觸活化過(guò)程提供"治病表面"。最終導(dǎo)致血管性疾病 影響子宮胎盤(pán)血流，最終導(dǎo)致妊娠期高血壓疾病。
[0018] 1. 6MTHFR與神經(jīng)管缺損
[0019]脊柱裂、無(wú)腦兒及腦脊膜膨出是一系列由于神經(jīng)管未閉引起的新生兒出生缺陷。 其發(fā)病機(jī)制與遺傳和環(huán)境因素等綜合作用相關(guān)。在懷有神經(jīng)管缺陷患兒的婦女血中有輕度 高半胱氨酸（Hey)水平上升的現(xiàn)象，且懷孕期間母體Hey濃度輕度升高或蛋氨酸濃度輕度 降低將會(huì)干擾神經(jīng)管閉合。5, 10-亞甲基四氫葉酸在半胱氨酸的代謝中有非常重要的地位， 它催化5, 10-亞甲基四氫葉酸還原成5-亞甲基四氫葉酸，而后者將甲基轉(zhuǎn)給高半胱氨酸使 其生成蛋氨酸。MTHFR的缺陷必將導(dǎo)致Hey向蛋氨酸的轉(zhuǎn)化發(fā)生障礙，形成高半胱氨酸血 癥，從而干擾神經(jīng)管閉合而產(chǎn)生神經(jīng)管缺陷。
[0020] 1. 7MTHFR與心臟缺陷
[0021] 在新生兒先天畸形中先天性心臟缺損是最常見(jiàn)的。先天性心臟缺損在新生兒中可 獨(dú)立發(fā)生也可能與其他并發(fā)癥同時(shí)發(fā)生，先天性心臟缺損中的冠心病已經(jīng)被證實(shí)是由遺傳 和環(huán)境因素共同決定引起的。有研宄證明孕婦可服用含葉酸的口服液來(lái)降低先天性心臟缺 損的發(fā)生，可降低約58%。由于葉酸對(duì)冠心病的抑制作用，因此葉酸的代謝便與冠心病息息 相關(guān)，作為葉酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶MTHFR在此途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MTHFR發(fā)生突變 后其酶活性將降低，導(dǎo)致葉酸代謝異常