新型重組雙功能融合蛋白及其制法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新型重組雙功能融合蛋白 及其制法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤、肝纖維化等疾病每年奪走幾千萬人的生命，造成數(shù)億美元的經(jīng)濟(jì)損失。細(xì)胞 膜表面的TGF-β和VEGFR受體和相應(yīng)配體的結(jié)合，是此類疾病產(chǎn)生和發(fā)展的一類重要原 因，因此開發(fā)相應(yīng)的蛋白配體藥物具有良好的應(yīng)用前景。
[0003] 目前公知的蛋白藥包括生長因子、激素類蛋白、酶類蛋白、細(xì)胞因子、干擾素、促紅 細(xì)胞生成素、以及融合蛋白等。除融合蛋白以外，其它蛋白藥均屬于均質(zhì)蛋白，即只含有一 種蛋白成分。而現(xiàn)有的融合蛋白藥（如阿瓦斯汀Avastin、阿柏西普Aflibercept)由受體 蛋白的膜外區(qū)與人IgG Fc段融合而成，雖然含有兩種或兩種以上蛋白成分，但仍然只發(fā)揮 一種功能，即只能阻斷一種細(xì)胞膜內(nèi)源性受體與相應(yīng)配體的結(jié)合。
[0004] 雖然基因重組雙功能融合蛋白已有報(bào)道，但其組成及所對應(yīng)的靶點(diǎn)各異。迄今為 止可以同時與TGF-βΙ及VEGF結(jié)合、并同時阻斷這兩個靶點(diǎn)所誘導(dǎo)的生物學(xué)活性的雙功能 融合蛋白藥物未有報(bào)道。因此，開發(fā)此類新型雙功能融合蛋白藥物對延長患者的生存時間、 改善患者的生存質(zhì)量、降低死亡率具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型重組雙功能融合蛋白及其制法和用途。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包括融合在一起的以下 元件：
[0007] (i)任選的位于N端的信號肽；
[0008] (ii)第一蛋白元件；
[0009] (iii)第二蛋白元件；以及
[0010] (iv)與第一蛋白元件和/或第二蛋白元件連接的免疫球蛋白元件，
[0011] 其中，所述信號肽可操作地連于由（ii)、（iii)和（iv)所構(gòu)成的融合元件；
[0012] 并且第一蛋白元件為TGF-β受體膜外區(qū)蛋白元件；第二蛋白元件為包括血管內(nèi) 皮細(xì)胞生長因子受體VEGFRl第二膜外區(qū)D2的蛋白元件。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的"可操作地連于"指所述信號肽可引導(dǎo)所述融合元件的表 達(dá)或跨膜轉(zhuǎn)移（定位）。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白具有選自下組的結(jié)構(gòu)：
[0015] (1)式Ia或式Ib所述結(jié)構(gòu)：
[0016] D-A-B-C (Ia)，或
[0017] D-B-A-C (Ib)
[0018] (2)式II a或式II b所述結(jié)構(gòu)：
[0019] D-A-C-B (Ila)，或
[0020] D-B-C-A ( II b)
[0021] 其中，
[0022] A為TGF-β受體膜外區(qū)蛋白元件；
[0023] B為包括血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體VEGFRl第二膜外區(qū)D2的蛋白元件；
[0024] C為免疫球蛋白元件；
[0025] D為任選的信號肽序列；
[0026] " "表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述元件A選自下組：T β RI、T β RII、T β RIII。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述元件A為Τβ RII膜外區(qū)的蛋白元件。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述元件A具有SEQ ID NO. :1中第24-184位所示的氨基酸序 列。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B具有SEQ ID NO. : 1中第190-282位所示的氨基酸序 列（核心序列）并且長度為94、95、96、97、98、99、或100個氨基酸。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述元件B中位于SEQ ID NO. : 1中第190-282位所示的氨基酸 序列（核心序列）兩側(cè)的氨基酸序列分別來自于天然VEGFRl的第二膜外區(qū)D2(D〇main2，） 兩側(cè)氨基酸序列。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述D2具有側(cè)翼序列，所述側(cè)翼序列包括：
[0033] 位于D2氨基端的第一側(cè)翼序列；和/或位于D2羧基端的第二側(cè)翼序列。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述第一側(cè)翼序列由1-5個氨基酸殘基組成。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述第二側(cè)翼序列由1-2個氨基酸殘基組成。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一和第二側(cè)翼序列分別來自天然VEGFRl的第二膜外 區(qū)D2(SEQ ID NO. : 1中第190-282位）兩側(cè)氨基酸序列。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述第一側(cè)翼序列為SDTGR。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述第二側(cè)翼序列為NT。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述元件C為人免疫球蛋白IgGl的Fe片段。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的肽接頭的長度為0-10氨基酸，較佳地為0-5個氨基酸。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白還包括信號肽元件D。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述信號肽元件D的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1中第1-23位所 /Jn 〇
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白不含信號肽，并且結(jié)構(gòu)式選自下組：
[0045] (1)式la'或式lb'所述結(jié)構(gòu)：
[0046] A-B-C (la，），或
[0047] B-A-C (lb，）
[0048] (2)式II a'或式II b'所述結(jié)構(gòu)：
[0049] A-C-B ( II a，），或
[0050] B-C-A ( II b')
[0051] 式中，A、B、C和的定義如上所述。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白具有以下多種功能：
[0053] a)與 VEGF 的結(jié)合活性 EC5tl 為 0· 6-2nM ;
[0054] b)與 TGF- β 1 的結(jié)合活性 EC5。為 L 5-2. 5nM ;
[0055] c)可以同時與VEGF和TGF- β 1兩種配體結(jié)合；
[0056] d)可阻斷VEGF誘導(dǎo)的體外或體內(nèi)血管形成；
[0057] e)可抑制TGF-β 1所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。
[0058] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種蛋白二聚體，所述的二聚體由兩個根據(jù)本發(fā)明第 一方面的任一所述的融合蛋白構(gòu)成。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述二聚體具有選自下組的結(jié)構(gòu)：
[0060] (1)式Ia-I或式Ib-I所述結(jié)構(gòu)：
[0061]
[0062] (2)式II a-Ι或式II b-Ι所述結(jié)構(gòu)：
[0063]
[0064] 其中，
[0065] A為TGF- β受體膜外區(qū)蛋白元件；
[0066] B為包括VEGFR第二膜外區(qū)D2的蛋白元件；
[0067] C為免疫球蛋白元件；
[0068] D為任選的信號肽序列；
[0069] 表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭；
[0070] " II"表示二硫鍵。
[0071] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白不含信號肽，并且具有選自下組的結(jié)構(gòu)：
[0072] (1)式Ia-Ι'或式Ib-Ι'所述結(jié)構(gòu)：
[0073]
[0074] (2)式II a-?；蚴絀I b-Γ所述結(jié)構(gòu)：
[0075]
[0076] 式中，A、B、C、"_"和" Il "的定義如上所述。
[0077] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼根據(jù)本發(fā) 明第一方面的所述的融合蛋白。
[0078] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第三方面所述的多核苷酸。
[0079] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明第四方面所述的載體或 基因組中整合有本發(fā)明第三方面所述的所述的多核苷酸。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞（如CHO細(xì)胞、NSO細(xì)胞、 293細(xì)胞）。
[0081] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種產(chǎn)生蛋白的方法，它包括步驟：
[0082] (1)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出權(quán)利要求 1所述的融合蛋白；和
[0083] (2)分離所述融合蛋白或由所述融合蛋白形成的二聚體。
[0084] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含：
[0085] 根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白和/或根據(jù)本發(fā)明第二方面所述的蛋白二 聚體，以及
[0086] 藥學(xué)上可接受的載體。
[0087] 本發(fā)明的第八方面，提供了根據(jù)本發(fā)明第一方面所述的融合蛋白和/或根據(jù)本發(fā) 明第二方面所述的蛋白二聚體的用途，用于制備治療疾病的藥物。
[0088] 在另一優(yōu)選例中，所述的疾病為與TGF-β及VEGF相關(guān)的疾病。
[0089] 在另一優(yōu)選例中，所述的疾病選自：腫瘤、肝臟纖維化。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤包括：大腸癌腫瘤、肺癌腫瘤、肝癌腫瘤、乳腺癌腫瘤、 胃癌腫瘤、胰腺癌腫瘤。
[0091] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種抑制與TGF-β及VEGF相關(guān)疾病的方法，包括步 驟：給需要的對象施用第一方面所