一種用于n-糖蛋白去糖基化的糖苷酶及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于糖生物學領域，涉及病原生物學、分子生物學、生物化學，具體涉及新 型糖苷酶、其應用和使用方法。
【背景技術】
[0002] 1.糖基化
[0003] 糖基化是蛋白質翻譯后修飾中最主要的修飾之一，在蛋白質翻譯調控、蛋白質降 解等過程中起著非常重要的作用（1)。50%以上的蛋白質以糖蛋白的形式存在，并且越來越 多的研究表明，糖基化異常可導致人類疾?。?)。在臨床治療過程中，使用的抗體藥物均帶 有糖基化（3)。
[0004] 根據蛋白質與糖鏈連接方式的不同，糖基化可以大致分為四種類型：N-連 接糖基化、0-連接糖基化、C-甘露糖糖基化和糖基磷脂酰肌醇（glycophosphatidly inositol, GPI)錨定連接。0-連接糖基化是指寡糖鏈與Ser、Thr、羥基賴氨酸或輕脯氨酸 的羥基相連（4)，例如如人血纖維蛋白溶酶原、人免疫球蛋白IgA等。C-甘露糖糖基化是指 甘露糖基通過C-C鍵連接到色氨酸吲哚環(huán)2號位C上（5)，例如膠原。糖基磷脂酰肌醇錨定 連接，GPI錨的一般結構主要是由乙醇胺、糖核心和肌醇連接而成，肌醇最終通過磷酸基團 與細胞膜中的磷脂結構相連，乙醇胺則與蛋白質的羧基端相連，糖沒有直接和蛋白質連接 而是通過乙醇胺磷酸鹽橋接于核心聚糖(6)，例如細胞表面受體、膜蛋白。N-連接糖基化是 寡糖鏈（GlcNAC的β-羥基）與Asn的酰胺基氨基形成N-連接糖蛋白（5)，例如人免疫球 蛋白、轉鐵蛋白等。本章重點闡述N-連接糖基化。
[0005] N-連接糖基化是研究最多的一種蛋白質的糖基化形式，Asn-X-Ser/Thr結構的 (X-脯氨酸外的任意一種氨基酸）Asn酰胺基氨基與寡糖鏈（GlcNAC的β -羥基）N-連接 糖蛋白。在動物細胞中，與天冬酰胺連接的糖，幾乎都是N-乙酰葡糖胺（GlcNAc)，而且連 接方式總是β構型（7)。N-連接糖有共同的特點是有五糖核心（2個N-乙酰葡糖胺和3 個甘露糖）。與DNA和蛋白質相比，糖蛋白糖鏈的結構更加多樣，根據它們的外層鏈（outer chain)結構的不同，可分為：高甘露糖型（high mannose)、雜合型（hybrid type)與復合型 (complex type)。三者的區(qū)別在于，高甘露糖型只含有多個α-連接的甘露糖殘基，而復雜 型含有以巖藻糖（Fuc)、半乳糖（Gal)和唾液糖（SA)為組分的糖鏈殘基，雜合型則兼有兩種 特點。在復雜型和雜合型糖鏈中，根據核心巖藻糖連接方式不同，還分為α-1，3連接核心 巖藻糖和α-1，6連接核心巖藻糖，結構如圖8所示。
[0006] 2.去糖基化酶
[0007] 近年來，糖生物學的研究日益受到生物學家的關注，蛋白質的糖基化修飾和糖蛋 白的去糖基化是研究糖蛋白中糖鏈結構和功能的重要手段。目前階段去糖基化的手段主要 有酶法、化學法，其中酶法被認為是比較理想的方法，該法能保持蛋白質的完整性，并且適 宜于許多糖蛋白。根據切除糖鏈位點，去糖基化酶分為三類：外切型糖苷酶、內切型糖苷酶 和N-糖苷酶（Ν-糖酰胺酶）。
[0008] 外切型糖苷酶（Exo-glycosidase)是研究最早的一類糖生物學研究的工具酶，能 從糖鏈的外端切除糖鏈釋放單個糖，如流感病毒表面的神經氨酸酶（ΝΑ)、α -甘露糖苷酶、 β -甘露糖苷酶、β -木糖苷酶等。
[0009] 內切型糖苷酶（Endo-glycosidase)都是從糖鏈內部專一性切開某個鍵，因此在糖 鏈結構分析以及結構與功能關系研究中非常有用，也是目前糖基化工程中的重要酶，例如 常用的 Endo F、Endo H。
[0010] 本申請的發(fā)明人擬提供提供一種新型的N-糖苷酶，尤其是具有將N-糖鏈從蛋白 質上完整切除的酶活功能的酶。
[0011] 與本發(fā)明相關的參考文獻：
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