一種從葡萄果實(shí)中大量提取總dna的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明涉及一種從植物中提取物植物DNA的方法，特別涉及一種從葡萄果實(shí)中大量提取總DNA的方法。
【背景技術(shù)】
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[0002]葡萄作為一種重要果樹(shù)品種，經(jīng)常會(huì)需要進(jìn)行相關(guān)的研宄。而在研宄葡萄分子生物學(xué)的過(guò)程中，有著相當(dāng)多提取DNA的需要。提取DNA是進(jìn)行基因庫(kù)構(gòu)建、基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化、分子標(biāo)記等分子實(shí)驗(yàn)的研宄基礎(chǔ)。這樣一個(gè)普通的試驗(yàn)步驟對(duì)于后期的進(jìn)一步試驗(yàn)起著十分重要的作用。提取DNA的產(chǎn)量，質(zhì)量，和提取時(shí)間，對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，可靠性有著較大的影響。
[0003]在提取植物總DNA的方法中，目前人們一般采用所有植物通用的提取方法例如CTAB法和SDS法等。這些提取方法步驟基本相似，首先破碎植物細(xì)胞壁，接著使核蛋白復(fù)合體中的蛋白充分變性，實(shí)驗(yàn)核蛋白與核酸的分離，然后將DNA與成語(yǔ)雜質(zhì)分離，得到純凈的DNA。這些方法沒(méi)有特定的提取樣品，所以導(dǎo)致對(duì)葡萄果實(shí)的提取效率不高。
[0004]葡萄果實(shí)中富含大量的多糖類(lèi)和酚類(lèi)化合物，并且在成熟時(shí)會(huì)有大量的水分。這些物質(zhì)在提取的過(guò)程中常與核酸形成復(fù)合物或者被氧化，不利于核酸的提純。所以在提取果實(shí)總DNA時(shí)，通用方法沒(méi)有考慮到上述問(wèn)題，因此缺少很多必要步驟，導(dǎo)致提取效率下降。
[0005]本發(fā)明提供了一種從葡萄果實(shí)中提取總DNA的方法，針對(duì)葡萄果實(shí)中多酚、多糖和成熟時(shí)期水分多等問(wèn)題，來(lái)高效快速的提取葡萄果實(shí)中的總DNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0006]本發(fā)明提供了一種從葡萄果實(shí)中提取總DNA的方法，所述方法，包括以下步驟:
[0007]步驟I，將葡萄果實(shí)磨成顆粒；
[0008]步驟2，顆粒用山梨醇提取，過(guò)濾掉多糖成分，余下葡萄渣I ;
[0009]步驟3，葡萄渣I用巰基乙醇提取，過(guò)濾掉酚類(lèi)成分；余下葡萄渣2
[0010]步驟4，葡萄渣2再用氯仿，異戊醇和KAc混合物提取，過(guò)濾掉蛋白成分，余下葡萄渣3，即為本發(fā)明的葡萄果實(shí)中的總DNA。
[0011]優(yōu)選的，本發(fā)明的方法如下:
[0012](I)取新鮮或者冷凍的葡萄果實(shí)，加入液氮后使凍結(jié)，然后充分研磨得到冷凍顆粒；
[0013](2)將冷凍顆粒加入離心管中，向離心管中加入緩沖液，山梨醇，巰基乙醇；
[0014](3)震湯均勾后尚心；
[0015](4)將上清去掉，沉淀中加入緩沖液，CTAB, NaCl, EDTA和巰基乙醇；
[0016](5)震蕩溫育；
[0017](6)加入KAc，乙醇，氯仿；
[0018](7)室溫震蕩，離心；
[0019](8)上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管，加入等體積的氯仿；
[0020](9)室溫震蕩，離心；
[0021](10)上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管，加入LiCl和異丙醇，加入巰基乙醇，冷藏放置；
[0022](11)離心；
[0023](12)上清倒掉，沉淀干燥；
[0024](13)加入 DEPC 溶解；
[0025](14)得到 DNA 溶液；
[0026](15)在溶解后的DNA溶液中加入RNA酶，混勻；
[0027](16)放入 37°C孵育；
[0028](17)加入苯酚:氯仿混合溶液，離心；
[0029](18)加入異丙醇和醋酸鈉，冷藏放置；
[0030](19)再離心；
[0031](20)去掉上清，沉淀干燥加入TE保存。
[0032]最優(yōu)選的，本發(fā)明的制備方法見(jiàn)實(shí)施例。
[0033]本發(fā)明的有益效果如下:
[0034]本發(fā)明最優(yōu)選的技術(shù)方案，和現(xiàn)有技術(shù)相比，可以有效去除葡萄果實(shí)中的多酚多糖，增加提取果實(shí)中總DNA的效率，其DNA收率為67%，最高可達(dá)80%。純度A260/A280為 1.75-1.85.
[0035]其多糖的含量極低，少于0.05%，其多酚的含量極低，少于0.05%?？傠s質(zhì)的含量少于0.1%。
[0036]本發(fā)明的DNA提取方法重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、瓊脂糖電泳條帶清晰，為進(jìn)一步開(kāi)展后續(xù)研宄奠定了工作基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
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[0037]圖1:用本方法和其他方法提取的DNA，說(shuō)明:I?3泳道為用傳統(tǒng)方法提取的DNA，4?6泳道為本方法提取的DNA，7泳道為DL2000Marker.
[0038]圖2:用本方法提取的DNA進(jìn)行基因Actin的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖
[0039]圖3:用本方法提取的DNA進(jìn)行基因GAPDH的PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖
【具體實(shí)施方式】
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[0040]以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0041]實(shí)施例1
[0042](I)取1g新鮮或者冷凍的葡萄果實(shí)，液氮充分研磨；
[0043](2)加入預(yù)冷的50ml離心管中，向離心管中加入20ml清洗緩沖液(0.1M Tris-硼酸(pH7.4),0.35M 山梨醇，10% PEG6000, 2%巰基乙醇)；
[0044](3)震蕩均勻，40C，8000rpm 離心 1min ；
[0045](4)將上清去掉，沉淀中加入約15ml CTAB緩沖液(0.1M Tris-硼酸(pH7.4),2%CTAB, 1.4M NaCl, 20mmol/l EDTA (ρΗ8.0)，2%巰基乙醇)；
[0046](5) 55°C溫育30min (CTAB緩沖液可提前預(yù)熱)，溫育期間手搖震蕩幾次；
[0047](6)加入 1.5ml 的 5M KAc, 1.5ml 的無(wú)水乙醇,15ml 氯仿；
[0048](7)放入搖床室溫震蕩20min, 100rpm離心1min ；
[0049](8)上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管，加入等體積的氯仿；
[0050](9)放入搖床室溫震蕩20min, 100rpm離心1min ；
[0051](10)上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管，加入1/3體積1M LiCl和0.8倍體積的預(yù)冷的異丙醇，加入I %巰基乙醇，_20°C放置2-4h ；
[0052](11) 100rpm 離心 30min ；
[0053](12)上清倒掉，沉淀在超凈工作臺(tái)中風(fēng)吹干燥1min ;
[0054](13)加入500 μ I DEPC水溶解，放入50°C水浴中1min助溶；
[0055](14) DNA溶液用移液器吸到2ml離心管；
[0056](15)在溶解后的DNA溶液中加入5 μ I RNA酶，混勻；
[0057](16)放入 37°C，10min ;
[0058](17)加入500 μ I苯酚:氯仿(24:1)，12000rpm離心5分鐘進(jìn)行抽提，重復(fù)一次；
[0059](18)加入2/3體積的冰凍異丙醇和1/10體積的3M醋酸鈉，_20°C放置4小時(shí)；
[0060](19) 12000rpm 離心 5 分鐘；
[0061](20)去掉上清，沉淀在超凈工作臺(tái)中風(fēng)吹干燥1min ；
[0062](21)加入100 μ I TE溶解，放入50°C水浴中1min助溶；
[0063](22)溶解的DNA可用于后續(xù)的試驗(yàn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從葡萄果實(shí)中提取總DNA的方法，所述方法，包括以下步驟: 步驟I，將葡萄果實(shí)磨成顆粒； 步驟2，顆粒用山梨醇提取，過(guò)濾掉多糖成分，余下葡萄渣I ; 步驟3，葡萄渣I用巰基乙醇提取，過(guò)濾掉酚類(lèi)成分；余下葡萄渣2步驟4，葡萄渣2再用氯仿，異戊醇和KAc混合物提取，過(guò)濾掉蛋白成分，余下葡萄渣3，即為本發(fā)明的葡萄果實(shí)中的總DNA。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟如下: (1)取新鮮或者冷凍的葡萄果實(shí)，加入液氮后使凍結(jié)，然后充分研磨得到冷凍顆粒； (2)將冷凍顆粒加入離心管中，向離心管中加入緩沖液，山梨醇，巰基乙醇； (3)震湯均勾后尚心； (4)將上清去掉，沉淀中加入緩沖液，CTAB,NaCl, EDTA和巰基乙醇； (5)震蕩溫育； (6)加入KAc，乙醇，氯仿； (7)室溫震湯，尚心； (8)上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管，加入等體積的氯仿； (9)室溫震湯，尚心； (10)上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管，加入LiCl和異丙醇，加入巰基乙醇，冷藏放置； (11)離心； (12)上清倒掉，沉淀干燥； (13)加入DEPC溶解； (14)得到DNA溶液； (15)在溶解后的DNA溶液中加入RNA酶，混勻； (16)放入37°C孵育； (17)加入苯酚:氯仿混合溶液，離心； (18)加入異丙醇和醋酸鈉，冷藏放置； (19)再離心； (20)去掉上清，沉淀干燥加入TE保存。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟如下: (1)取1g新鮮或者冷凍的葡萄果實(shí)，用液氮凍結(jié)后充分研磨； (2)研磨后的果實(shí)加入預(yù)冷的50ml離心管中，向離心管中加入20ml清洗緩沖液(0.1MTris-硼酸(pH7.4),0.35M 山梨醇，10% PEG6000, 2%巰基乙醇)； (3)震蕩均勾,4°C, 8000rpm 離心 1min ； (4)將上清去掉，沉淀中加入15mlCTAB緩沖液(0.1M Tris-硼酸(pH7.4),2%CTAB, 1.4M NaCl, 20mmol/l EDTA (ρΗ8.0)，2%巰基乙醇)； (5)55°C溫育30min(CTAB緩沖液可提前預(yù)熱)，溫育期間手搖震蕩幾次； (6)加入1.5ml的5M KAc, 1.5ml的無(wú)水乙醇,15ml氯仿； (7)放入搖床室溫震蕩20min,100rpm離心1min ； (8)上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管，加入等體積的氯仿； (9)放入搖床室溫震蕩20min,100rpm離心1min ； (10)上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管，加入1/3體積1MLiCl和0.8倍體積的預(yù)冷的異丙醇，加入I %巰基乙醇，_20°C放置2-4h ；(11)100rpm 離心 30min ； (12)上清倒掉，沉淀在超凈工作臺(tái)中風(fēng)吹干燥1min; (13)加入500μ I DEPC水溶解，放入50°C水浴中1min助溶； (14)DNA溶液用移液器吸到2ml離心管； (15)在溶解后的DNA溶液中加入5μ I RNA酶，混勻；(16)放入37°C，1min ； (17)加入500μ I苯酚:氯仿(24:1)，12000rpm離心5分鐘進(jìn)行抽提，重復(fù)一次； (18)加入2/3體積的冰凍異丙醇和1/10體積的3M醋酸鈉，_20°C放置4小時(shí)；(19)12000rpm 離心 5 分鐘； (20)去掉上清，沉淀在超凈工作臺(tái)中風(fēng)吹干燥1min; (21)加入100μ I TE溶解，放入50°C水浴中1min助溶； (22)溶解的DNA可用于后續(xù)的試驗(yàn)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種從葡萄果實(shí)中大量提取總DNA的方法，所述方法，包括以下步驟：步驟1，將葡萄果實(shí)磨成顆粒；步驟2，顆粒用山梨醇提取，過(guò)濾掉多糖成分，余下葡萄渣1；步驟3，葡萄渣1用巰基乙醇提取，過(guò)濾掉酚類(lèi)成分；余下葡萄渣2步驟4，葡萄渣2再用氯仿，異戊醇和KAc混合物提取，過(guò)濾掉蛋白成分，余下葡萄渣3，即為本發(fā)明的葡萄果實(shí)中的總DNA。
【IPC分類(lèi)】C12N15/10
【公開(kāi)號(hào)】CN104975008
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510480832
【發(fā)明人】鄧洋, 陳志勇, 賈海鋒, 房經(jīng)貴, 施乃溶, 朱傳根, 施澤波, 張 榮
【申請(qǐng)人】江蘇綠之邦生態(tài)莊園有限公司, 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 揚(yáng)州海驊苗木有限公司
【公開(kāi)日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2015年8月3日