一種生物法合成(r)-(-)-扁桃酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及一種生物法合成（R)-(-)-扁桃酸的方法。
【背景技術】
[0002] 扁桃酸是極其重要的手性藥物中間體，具有消炎和殺菌的雙重作用。目前，在國際 市場上，對扁桃酸的需求約以年均10%左右的速度增長，尤其是（R)-扁桃酸早已成 為國內外急需的產(chǎn)品。
[0003] (R)-(-)-扁桃酸及其衍生物是合成環(huán)扁桃酯、羥芐唑、匹莫林等血管擴張劑、殺 菌劑、鎮(zhèn)痙劑的重要藥物中間體，且具有很好的生物分解性，是目前最受矚目的酸性光學拆 分劑，可使多數(shù)外消旋體胺類和氨基酸類經(jīng)非對映體異構鹽形成法進行光學拆分，如止咳 藥甲嗎南的中間體八氫異喳琳衍生物可由（R)-扁桃酸拆分。
[0004] 目前，常見的制備扁桃酸旋光性單體的方法大致有：（1)物理化學法，其中包括不 對稱合成法、光學異構體拆分法和層析法等，不對稱合成法可直接化學合成扁桃酸的異構 體，拆分法先合成外消旋體扁桃酸，再拆分獲得手性扁桃酸；(2)生物合成法，國外文獻報 道制備手性扁桃酸大致有3種方法：
[0005] 1、以苯甲醛和氫氰酸為原料，先制得扁桃腈，后在腈水解酶的作用下，得到（R)- (-)-扁桃酸，但是該方法僅是（R)-(-)-扁桃酸生產(chǎn)的一種研宄方向，由于受限于已知 的腈水解酶活力較低，目前還達不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
[0006] 2、先合成扁桃酸外消旋體，而后酯化或氨解獲得扁桃酸酯或扁桃酸酰胺，再在酯 化水解酶或酰胺水解酶的作用下，得到單一對映體扁桃酸，但是該方法同樣僅是（R)- 扁桃酸生產(chǎn)的一種研宄方向，目前受限于已知的酯化水解酶及酰胺水解酶活力較低，立體 選擇型較差，得到的（R)-(-)-扁桃酸純度低，目前也達不到工業(yè)應用的要求。
[0007] 3、以苯乙酮酸為底物直接利用具有氧化還原酶的微生物催化合成手性扁桃酸，但 是該方法也僅是一種研宄方向，同樣受限于目前已報道的酶活力低等問題，工業(yè)化應用困 難。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種生物法合成（R)-(-)-扁桃酸的方法，該方法的 反應條件溫和，并且原料扁桃腈具有較高的轉化率。
[0009] 為達到上述目的，本發(fā)明的解決方案是：
[0010] 一種生物法合成（R)-(-)-扁桃酸的方法，其包括如下步驟：將扁桃腈流加入轉 化液中，在pH為6. 0 - 9. 0和溫度為20 - 40°C的條件下反應20 - 24h，停止流加并繼續(xù)反 應2 - 6h，得到（R)-(-)-扁桃酸；其中，上述的轉化液含有用于分泌J2315腈水解酶的 E. co Ii工程菌。
[0011] 其中，整個流加反應過程（20 -24h)可以分為若干個不同的階段，每個階段采用不 同的流加速度，但要確保前一個階段的流加速度大于后一個階段的流加速度。在本發(fā)明的 優(yōu)選實施例中，整個流加反應過程（20 - 24h)可以分為兩個階段，在第一個階段（10 - 12h) 將扁桃腈以第一流加速度進行流加，在第二個階段（即剩余的流加反應時間）以第二流加 速度進行流加，但要保證第一流加速度大于第二流加速度。
[0012] 進一步地，第一流加速度可以為10 - 第二流加速度可以為 5 - 20gL 1Ii %另外，第一流加速度還可以優(yōu)選為15 - 35gL 1IiΛ第二流加速度還可以優(yōu)選 為7. 5 - 17. 5gL_ 1IT%進一步地，第一流加速度還可以優(yōu)選為20 - 30gL IΛ第二流加速度 還可以優(yōu)選為10 - ISgIZ1IT%更進一步地，第一流加速度還可以優(yōu)選為24gL "IT1，第二流 加速度還可以優(yōu)選為12gL 1I1入
[0013] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，pH可以優(yōu)選為7 -8. 5,還可以進一步優(yōu)選為7. 9 -8. 1。
[0014] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，溫度可以優(yōu)選為25 -37°C，還可以進一步優(yōu)選為30°C。
[0015] 在上述步驟中，轉化液的制備方法包括如下步驟：
[0016] (1)、將E. coli工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，離心以得到靜息細胞；
[0017] (2)、收集靜息細胞，并將其懸浮在pH為6. 0 - 9. 0的緩沖液中，得到轉化液。
[0018] 其中，在步驟（1)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及含量如下：酵母膏16-eogL1、蛋白胨 12 - SOgL - 1、甘油 I - 500mlL -^K2HPOJt 75gL -^KH2PO4S. dTgL - ^MgSOJgL - 1。
[0019] 在步驟（2)中的轉化液中，靜息細胞的濃度大于IOgL S可以優(yōu)選為10 -100gLΛ 還可以更優(yōu)選為10 - 50gL Λ可以最優(yōu)選為10 - 。
[0020] 步驟（2)中的緩沖液為 NaH2P04/Na2HP04緩沖液、KH 2Ρ04/Κ2ΗΡ04緩沖液、Tris - HCl 緩沖液或其他任何常用PH緩沖液中的任意一種；步驟（2)中還可以添加扁桃腈的助溶劑， 助溶劑為體積分數(shù)為1%_25%的甲醇、體積分數(shù)為1%-25%的乙醇、體積分數(shù)為1%-25% 的異丙醇、體積分數(shù)為1% - 25%的正己烷或其他任何常用有機溶劑中的任意一種或幾種。
[0021] 進一步地，步驟（2)中的緩沖液的濃度還可以為20 - 200mM，助溶劑的體積分數(shù)還 可以為5% - 10%。
[0022] 由于采用上述方案，本發(fā)明的有益效果是：
[0023] 本發(fā)明的方法以扁桃腈為起始原料，利用高密度發(fā)酵獲得的靜息細胞（用于分泌 J2315腈水解酶）為生物催化劑，并采用具有較高水解活性的J2315腈水解酶和扁桃腈的 流加工藝相結合來生產(chǎn)（R)-扁桃酸，不僅工藝路線簡單、反應條件溫和以及沒有污 染，而且能夠通過不斷控制扁桃腈的加入來實現(xiàn)（R)-扁桃酸的高濃度積累，使單批 次反應（R)-(-)-扁桃酸積累濃度高達2. 9M，ee值大于97 %，扁桃腈轉化率大于99 %，， 從而具有良好的工業(yè)化應用前景。另外，本發(fā)明的方法成本低廉，能耗也較低。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明的靜息細胞催化水解扁桃腈合成（R)-(-)-扁桃酸反應進程曲線 圖。
【具體實施方式】
[0025] 本發(fā)明公開了一種生物法合成（R)-(-)-扁桃酸的方法，該方法包括如下步驟：
[0026] (1)、將用于分泌J2315腈水解酶的E. coli工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)， 離心以得到靜息細胞；
[0027] (2)、收集步驟（1)所得的靜息細胞，將該靜息細胞懸浮于pH為6. 0 - 9. 0的緩沖 液中，得到轉化液；
[0028] (3)、將扁桃腈流加入步驟⑵所得的轉化液中，在pH為6.0-9.0和溫度為 20 - 40°C的條件下反應20 - 24h (即流加反應階段），然后停止流加，繼續(xù)反應2 - 6h (即非 流加反應階段），得到（R)-(-)-扁桃酸。
[0029] 其中，在步驟（1)中，J2315腈水解酶（BCJ2315)是伯克霍爾德氏菌J2315菌 株（Burkholderiacenocepacia J2315)分泌的。用于分泌J2315腈水解酶的E.coli工 程菌是通過在Escherichia coli M15中克隆BCJ2315基因并且過表達從而構建而成的 E.coli M15/BCJ2315 重組體（Recombinant E.coli M15/BCJ2315)。關于該 E.coli 工程 菌，請詳見Wang等人在BMC Biotechnology 2013, 13:14公開的非專利文獻《Discovery and characterization of a highly efficient enantioselective mandelonitrile hydrolase from BurkholderiacenocepaciaJ2315by phylogeny - based enzymatic substrate specificity prediction〉〉的記載。
[0030] 步驟（I)中的發(fā)酵培養(yǎng)基含有以下組分并且每種組分的含量如下：酵母膏 16 - 60g/L、蛋白胨 12 - 80gL -\ 甘油 I - 500mlL -\ Κ2ΗΡ0424· 75gL -\ ΚΗ2Ρ043· 47gL -\ MgSO4IgL 1O
[0031] 在步驟⑴中，還可以根據(jù)實際情況添加發(fā)酵補料培養(yǎng)基。
[0032] 在步驟⑵所得的轉化液中，靜息細胞的濃度應大于IOgL \優(yōu)選為10 -100gL S 更優(yōu)選為10 - SOgL1，最優(yōu)選為10 - ZOgL1。催化反應所需的J2315腈水解酶是通過靜息 細胞分泌的，所以靜息細胞的濃度影響的是J2315腈水解酶的濃度。而J2315腈水解酶的 濃度越高則相對的催化效率越高，即單位時間內扁桃腈的轉化量越高。理論上隨著靜息細 胞的濃度的提高，第一流加速度是可以成比例增加的，即第一流加速度所需靜息細胞的濃 度等于在15 - 20min內能夠完全轉化IOOmM扁桃腈的靜息細胞的濃度。
[0033] 步驟⑵中的緩沖液為NaH2P04/Na2HP0jl沖液、KH 2Ρ04/Κ2ΗΡ04緩沖液中、Tris - HCl緩沖液或其他任何常用pH緩沖液中的任意一種。
[0034] 步驟（2)中除了添加緩沖液外，還可以添加扁桃腈的助溶劑，助溶劑為體積分數(shù) 為1% -25%的甲醇、乙醇、異丙醇和正己烷中的任意一種或幾種。該緩沖液的濃度可以為 20 - 200mM，助溶劑添加量可以為5% - 10% (v/v)。
[0035] 在步驟（3)中，扁桃腈在整個流加反應過程的不同階段可以以不同的流加速度進 行流加。在流加反應初始的10 - 12h，扁桃腈可以以第一流加速度進行流加，在剩余的流加 反應時間內，扁桃腈可以以第二流加速度進行流加，但第一流加速度應大于第二流加速度， 并且優(yōu)選為第二流加速度的兩倍。本發(fā)明在整個流加反應過程（20 -24h)的不同階段采用 不同的流加速度進行流加的原因如下：扁桃腈對J2315腈水解酶具有一定的毒性，隨著流 加反應的進行，J2315腈水解酶的催化效率會逐漸降低。第一流加速度采用較大的數(shù)值能 夠充分利用J2315腈水解酶的最高催化效率，而當J2315腈水解酶的催化效率降低至一定 程度，則采用第二流加速度從而保證扁桃腈被充分轉化。如果整個流加反應的全過程只采 用第一流加速度則會導致扁桃腈轉化效率降低，而整個流加反應的全過程均采用第二流加 速度則會導致J2315腈水解酶的催化效率的浪費。
[0036] 整個反應過程中J2315腈水解酶的催化效率由于受到扁桃腈毒性的影響是逐漸 降低的，從而導致在每小時中能夠轉化的扁桃腈的量是逐漸降低的。第一流加速度可以認 為是在J2315腈水解酶的催化效率最高的情況下每小時可以轉化的扁桃腈的量，當J2315 腈水解酶的催化效率降低時，為保證扁桃腈能夠完全轉化則需要降低扁桃腈的流加速度。 若從整個反應的全局考慮，則只需保證反應結束時扁桃腈能夠達到理論上1