一種利用鱈魚(yú)魚(yú)肉制造ace抑制肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品深加工領(lǐng)域，特別涉及鱈魚(yú)魚(yú)肉的深加工。
【背景技術(shù)】
[0002] 高血壓作為一種多病因、進(jìn)展性心血管疾病，臨床表現(xiàn)全身主動(dòng)血壓升高，患者的 收縮壓> 140mmHg，舒張壓>90mmHg。隨著病情的發(fā)展，血壓持續(xù)升高，繼而出現(xiàn)心、腦、腎 和視網(wǎng)膜等器官損傷，導(dǎo)致充血性心力衰竭、腦卒中、冠心病、腎功能衰竭、主動(dòng)脈瘤的發(fā)病 率和病死率升高。高血壓是一種患病率極高的疾病，已成為全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn) 題。據(jù)國(guó)際高血壓學(xué)會(huì)發(fā)表的新聞公報(bào)，全球高血壓或血壓偏高人群已有9. 72億人，約占 世界成年人口的26. 4%。世界衛(wèi)生組織（WHO)對(duì)全球各種疾病的死亡統(tǒng)計(jì)，以高血壓等為 代表的心腦血管疾病死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的比例將由1997年的28. 8%上升至2002年的 36.0%。我國(guó)高血壓流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，
[0003] 目前用于高血壓治療的藥物主要有六大類(lèi)：分別是利尿降壓藥、β -受體阻滯劑、 鈣拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI)、血管緊張素 II受體拮抗劑（ARB)和α 1-受體 阻滯劑。這些藥物在高血壓的治療中取得了很好的效果。其中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是 唯一擁有全部6個(gè)強(qiáng)適應(yīng)證（心力衰竭、心肌梗死、冠心病高危因素、糖尿病、慢性腎病、預(yù) 防中風(fēng)復(fù)發(fā)）的一線(xiàn)抗高血壓藥物。ACEI在腎性高血壓、慢性腎小球腎炎、慢性腎功能衰竭 及治療預(yù)防糖尿病腎病的作用上已得到肯定。
[0004] ACE抑制肽指的是一類(lèi)具有ACE抑制活性的多肽。這些多肽的氨基酸序列和肽鏈 長(zhǎng)度各有不同，但都具有類(lèi)似的活性。ACE具有兩個(gè)活性部位，分別名為N-區(qū)、C-區(qū)，這兩個(gè) 活性區(qū)域具有類(lèi)似的功能，只是對(duì)不同底物的親和力有所不同。ACE抑制肽對(duì)ACE的結(jié)合， 抑制管緊張素 I，從而阻礙ACE催化血管緊張素 I水解成為血管緊張素 II，從而起到降血壓 作用。目前，許多研究表明食品中的一些短肽存在降血壓作用。人們已經(jīng)從許多食品來(lái)源 的材料中發(fā)現(xiàn)了 ACE抑制肽。從來(lái)源上，食源ACE抑制肽可分為三類(lèi)：來(lái)自乳蛋白的肽類(lèi)， 包括乳酪蛋白、乳球蛋白和乳清蛋白；來(lái)自植物蛋白的肽類(lèi)，如大米多肽、大豆多肽、玉米多 肽等；來(lái)自魚(yú)貝類(lèi)的肽類(lèi)，如羅非魚(yú)多肽、帶魚(yú)多肽、金槍魚(yú)多肽、沙丁魚(yú)多肽、南極磷蝦多 肽等。雖然這些ACE抑制肽的降壓效果沒(méi)有合成藥物強(qiáng)烈，但是它們具有安全、無(wú)毒副作用 的特點(diǎn)吸引了眾多研究者。從天然食品蛋白中發(fā)現(xiàn)的短鏈ACE抑制肽，不僅體外實(shí)驗(yàn)證明 對(duì)ACE有較強(qiáng)的抑制活性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體臨床實(shí)驗(yàn)的降血壓效果也十分令人振奮。這為 通過(guò)功能食品預(yù)防和緩解高血壓提供了新的途徑。
[0005] 鱈魚(yú)主要分布于北太平洋，北大西洋兩側(cè)的一般棲于近底層，由近岸帶到深海區(qū)， 在中國(guó)主要分布于渤海、黃海和東海北部。黃海北部、山東高角東南偏東和海洋島南部及東 南海區(qū)有主要的漁場(chǎng)。鱈魚(yú)肉質(zhì)白細(xì)鮮嫩，清口不膩、世界上不少?lài)?guó)家把鱈魚(yú)作為主要食用 魚(yú)類(lèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種使用鱈魚(yú)魚(yú)肉制備ACE抑制肽的方法。
[0007] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0008] 利用鱈魚(yú)魚(yú)肉制造 ACE抑制肽的方法，包括如下步驟：
[0009] 1)將鱈魚(yú)魚(yú)肉洗凈，加入水，勻漿處理之后加熱將酶滅活，得到漿液A ;
[0010] 2)將漿液A冷卻至不高于60°C，加入蛋白酶酶解，得到酶解液；
[0011] 3)將酶解液離心，收集上清液A ;
[0012] 4)在上清液A中加入碳酸鈣，混勻，過(guò)濾得到澄清的上清液B ;
[0013] 5)使用截留分子量3000Da的中空纖維超濾裝置超濾，收集濾液，干燥得到ACE抑 制肽。
[0014] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，將上清液A加熱以使其中的蛋白酶滅活。
[0015] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，干燥得到的ACE抑制肽進(jìn)一步經(jīng)過(guò)Sephadex G-15和 RP-HPLC兩步分離純化得到高純度的ACE抑制肽。
[0016] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，勻漿處理之后加熱至90°C保溫至少lOmin，以將酶滅 活。
[0017] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，將漿液A冷卻至45~55 °C，調(diào)節(jié)其pH至7. 5~8. 5， 之后加入蛋白酶酶解。
[0018] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，鱈魚(yú)魚(yú)肉與水的質(zhì)量比為1 : 3。
[0019] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，碳酸鈣的加入量為上清液A質(zhì)量的10%。
[0020] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，蛋白酶的酶解時(shí)間為120~240min。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是：
[0022] 本發(fā)明方法可以將低價(jià)值的鱈魚(yú)魚(yú)肉轉(zhuǎn)化為具有較高價(jià)值的ACE抑制肽，變廢為 寶，充分利用了資源。
[0023] 本發(fā)明方法工藝路線(xiàn)簡(jiǎn)單易行，操作簡(jiǎn)單，所使用的設(shè)備為成熟設(shè)備，投資成本較 低，ACE抑制肽回收率高。
[0024] 經(jīng)過(guò)S印hadex G-15和RP-HPLC兩步分離純化得到高純度的ACE抑制肽，具有極 好的生物活性，其抑制ACE的IC5tl值為10. 7 μ M。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 利用鱈魚(yú)魚(yú)肉制造 ACE抑制肽的方法，包括如下步驟：
[0026] 1)將鱈魚(yú)魚(yú)肉洗凈，加入水，勻漿處理之后加熱將酶滅活，得到漿液A ;
[0027] 2)將漿液A冷卻至不高于60°C，加入蛋白酶酶解，得到酶解液；
[0028] 3)將酶解液離心，收集上清液A ;
[0029] 4)在上清液A中加入碳酸鈣，混勻，過(guò)濾得到澄清的上清液B ;
[0030] 5)使用截留分子量3000Da的中空纖維超濾裝置超濾，收集濾液，干燥得到ACE抑 制肽。
[0031] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，將上清液A加熱以使其中的蛋白酶滅活。當(dāng)然，也可以 根據(jù)需要，使用其.他公知方法將其中的酶滅活。
[0032] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，干燥得到的ACE抑制肽進(jìn)一步經(jīng)過(guò)Sephadex G-15和 RP-HPLC兩步分離純化得到高純度的ACE抑制肽。
[0033] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，勻漿處理之后加熱至90°C保溫至少lOmin，以將酶滅 活。當(dāng)然，也可以根據(jù)需要，使用其他公知方法將其中的酶滅活。
[0034] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，將漿液A冷卻至45~55°C，調(diào)節(jié)其pH至7. 5~8. 5， 之后加入蛋白酶酶解。
[0035] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，鱈魚(yú)魚(yú)肉與水混合，是為了方便勻漿損傷，其質(zhì)量比可 以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，特別的，當(dāng)其質(zhì)量比為1 : 3,可以有效地減少水的用量，同時(shí)，對(duì)肽 的制備不利影響也比較小。
[0036] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，碳酸鈣的加入量為上清液A質(zhì)量的10%。
[0037] 作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，蛋白酶的酶解時(shí)間為120~240min。當(dāng)然，根據(jù)所使用 的酶和酶解溫度的不同，也可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)目s短或延長(zhǎng)。
[0038] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0039] 實(shí)施例1鱈魚(yú)魚(yú)肉的酶解和ACE抑制肽的富集
[0040] 1)原料的處理：稱(chēng)取IOOkg鱈魚(yú)魚(yú)肉，洗干凈后，加入300L去離子水，在打漿機(jī)中 進(jìn)行打漿處理后，煮沸20min，滅活自身酶系；
[0041] 2)酶解鱈魚(yú)魚(yú)肉：待鱈魚(yú)魚(yú)肉漿液，冷卻至55°C，調(diào)pH至8.0,加入入堿性蛋白酶 Alcalasel50g，酶解3hr，得到酶解液；
[0042] 3)滅活堿性蛋白酶Alcalase :將酶解液升溫至95°C，保溫IOmin,滅活酶解液中的 堿性蛋白酶Alcalase ;
[0043] 4)酶解液的預(yù)處理：將滅酶后的酶解液冷卻至室溫，采用管式離心機(jī)，于3000rpm 下離心，收集上清液；
[0044] 5)酶解液的澄清：在離心收集的上清液中加入10%輕質(zhì)碳酸鈣，板框過(guò)濾后得到 澄清、含ACE抑制肽的清液；
[0045] 6)大分子物質(zhì)的去除：采用截留分子量3000Da的中空纖維超濾裝置，超濾去除含 ACE抑制肽的清液中的大分子物質(zhì)，收集含ACE抑制肽的濾液；
[0046] 7) ACE抑制肽的干燥：將濾液噴霧干燥，即得到ACE抑制肽。
[0047] 實(shí)施例2高純度ACE抑制肽的制備
[0048] 采用S印hadex G-15分離粗品ACE抑制肽粉末的ACE抑制肽，凝膠柱，I. 8 X 60cm ; 樣品濃度，50mg / ml;上樣量，1.5ml ;流速，0.4ml / min;洗脫劑，0.02mol / L HAc-NaAc 緩沖液（pH4. 0);得到7個(gè)組分，其中組分E的活性較高；
[0049] 表1Sephadex G-15分離酶解產(chǎn)物所得組分的ACE抑制活性
[0050]
[0051] 利用 RP-HPLC 對(duì)組分 E 進(jìn)行純化，使用 Kromasil C18 12 μ m ST4. 6 / 250 (4. 6 X 250mm)色譜柱分離得到16個(gè)組分，其中組分FlO具有較高的ACE抑制活性，對(duì)純 化得到的單一活性組分FlO進(jìn)行經(jīng)氨基酸組成分析和鑒定，從鱈魚(yú)魚(yú)肉Alcalase酶解物中 分離出一種新的ACE抑制肽LPP，其IC5tl值為10. 7 μ M。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用鱈魚(yú)魚(yú)肉制造ACE抑制肽的方法，包括如下步驟： 1) 將鱈魚(yú)魚(yú)肉洗凈，加入水，勻漿處理之后加熱將酶滅活，得到漿液A ; 2) 將漿液A冷卻至不高于60°C，加入蛋白酶酶解，得到酶解液； 3) 將酶解液離心，收集上清液A ; 4) 在上清液A中加入碳酸鈣，混勻，過(guò)濾得到澄清的上清液B ; 5) 使用截留分子量3000Da的中空纖維超濾裝置超濾，收集濾液，干燥得到ACE抑制肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：將上清液A加熱以使其中的蛋白酶滅活。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：勻漿處理之后加熱至90°C保溫至少 lOmin，以將酶滅活。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：將楽液A冷卻至45~55°C， 調(diào)節(jié)其pH至7. 5~8. 5,之后加入蛋白酶酶解。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：鱈魚(yú)魚(yú)肉與水的質(zhì)量比為 1 : 3〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：蛋白酶為堿性蛋白酶 Alcalase07. 根據(jù)權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：碳酸鈣的加入量為上清液A 質(zhì)量的10%。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：蛋白酶的酶解時(shí)間為120~ 240min〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1~8任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：干燥得到的ACE抑制肽進(jìn) 一步經(jīng)過(guò)Sephadex G-15和RP-HPLC兩步分離純化得到高純度的ACE抑制肽。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用鱈魚(yú)魚(yú)肉制造ACE抑制肽的方法，通過(guò)將鱈魚(yú)魚(yú)肉洗凈與水混合，勻漿，酶解，板框過(guò)濾，超濾截留3000Da以下小分子，干燥后得到ACE抑制肽。進(jìn)一步使用Sephadex G-15和RP-HPLC兩步分離純化可以得到高純度的ACE抑制肽。本發(fā)明方法可以將低價(jià)值的鱈魚(yú)魚(yú)肉轉(zhuǎn)化為具有較高價(jià)值的ACE抑制肽，變廢為寶，充分利用了資源，具有工藝路線(xiàn)簡(jiǎn)單易行，操作簡(jiǎn)單，所使用的設(shè)備為成熟設(shè)備，投資成本較低，ACE抑制肽回收率高。
【IPC分類(lèi)】C07K1/20, A61P9/12, C12P21/06, C07K1/16
【公開(kāi)號(hào)】CN104975059
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410138184
【發(fā)明人】朱威, 雷楗勇, 賀雄雷, 潘武廣, 郭蕾
【申請(qǐng)人】廣州世優(yōu)生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2014年4月8日