一種假交替單胞菌重組氨肽酶的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種來(lái)自深海熱液口的假交替 單胞菌 Pseudoalteromonas telluritireducens 16098 氨肽酶（aminopeptidase)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨肽酶隸屬于金屬蛋白酶Ml家族，可水解蛋白質(zhì)或多肽的N末端氨基酸，廣泛 分布于動(dòng)、植物和微生物中，在各種生物過(guò)程中起重要作用。氨肽酶多為鋅離子依賴型金 屬蛋白酶，根據(jù)氨肽酶催化水解多肽N末端氨基酸的偏好性，可分為丙氨酸氨肽酶、亮氨酸 氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶和脯氨酸氨肽酶等，亮氨酸氨肽酶為其中最有代表性的一類。在 人體中，白三稀A4水解酶（leukotriene A-4 hydrolase，LTA4H)為一類重要的亮氨酸氨 肽酶，它由Peptidase_Ml和1^1^-44-117(11'〇_(]兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，與人體多種惡性腫瘤的發(fā) 生息息相關(guān)，可作為人類臨床肝膽疾病的診斷指標(biāo)。近年來(lái)，在大腸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿 菌BaciIIus stearothermophiIus、水稻黃單胞桿菌Xanthomonas oryzae、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureu等微生物中陸續(xù)報(bào)道了多種不同類型的氨肽酶，但在海洋微生物中 氨肽酶功能相關(guān)研宄較少，僅有科爾韋氏菌Colwellia psychrerythraea中的亮氨酸氨肽 酶及高溫球菌Thermococcus中的甲硫氨酸氨肽酶等。
[0003] 假交替單胞菌P. telluritireducens 16098分離自深海熱液口附近，其在高壓、 高鹽、少光照、極溫、高重金屬等環(huán)境因素的自然選擇下，必然會(huì)適應(yīng)產(chǎn)生一系列結(jié)構(gòu)新穎、 作用機(jī)制特殊并具有潛在應(yīng)用前景的功能蛋白，因此開(kāi)展功能蛋白的發(fā)掘及應(yīng)用基礎(chǔ)具有 十分重要的理論與實(shí)踐意義。P. telluritireducens 16098氨肽酶基因編碼區(qū)為1845bp， 編碼蛋白的成熟肽含593個(gè)氨基酸殘基，由Peptidase_Ml和Leuk-A4_hydro_C兩個(gè)結(jié)構(gòu)域 組成，與深海嗜冷微生物C. psychrerythraea中的低溫亮氨酸氨肽酶相似度為71. 4%，與 人LTA4H相似度為48. 7%。本發(fā)明將對(duì)P. telluritireducens 16098氨肽酶進(jìn)行體外原核 重組表達(dá)，對(duì)重組蛋白的酶學(xué)活性進(jìn)行深入研宄，研宄結(jié)果對(duì)深海微生物新型蛋白酶的開(kāi) 發(fā)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)自深海熱液口的假交替單胞菌Pseudoalteromonas telluritireducens 16〇98 氨肽酶（aminopeptidase)的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 一種假交替單胞菌重組氨肽酶的應(yīng)用，重組氨肽酶來(lái)自深海熱液口的假交替單胞 菌Pseudoalteromonas telluritireducens 16098氨肽酶的重組蛋白，其作為蛋白水解酶 的應(yīng)用。
[0007] 所述重組蛋白的獲得：
[0008] (1)所述P. telluritireducens 16098氨肽酶重組蛋白是在其成熟肽編碼區(qū)的兩 端分別設(shè)計(jì)含有限制性酶切位點(diǎn)的引物（序列為5' -CATATGAACGCGATTGATCAAAACTCAT-3' 和 5' -CTCGAGTTATTTATCAAATAAAGCGTC-3' ）；
[0009] (2)而后通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得編碼區(qū)基因，并將其克隆到pET-30a(+)表達(dá)載體中，隨 后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌Transetta(DE3)中實(shí)現(xiàn)原核體外重組表達(dá)；
[0010] (3)P. telluritireducens 16098氨肽酶重組蛋白在非變性條件下利用鎳瓊脂糖 凝膠柱進(jìn)行純化。
[0011] 所述 P. telluritireducensl6098 氨肽酶的重組蛋白在 28°C、pH 7. 2 時(shí)，對(duì) L-亮 氨酸7-氨基-4-甲基香豆素具有顯著的氨肽酶活性，其Km值為44. 56 ±5. 09 μ mol L'
[0012] 所述P. telluritireducens 16098氨肽酶的重組蛋白的最適溫度范圍為 28°C -40°C，在50°C以上熱穩(wěn)定性較低。
[0013] 所述P. telluritireducens 16098氨肽酶的重組蛋白的最適pH范圍為7. 2-8. 0， 且在pH 9. 0-12. 2時(shí)可檢測(cè)到活性。
[0014] 所述P. telluritireducens 16098氨肽酶重組蛋白可耐受高鹽濃度及部分金屬 離子，但低鹽濃度及Cu2+、Zn2+和Cd2+等金屬離子可顯著抑制重組蛋白活性，EDTA、蛋白酶抑 制劑等亦對(duì)重組蛋白的活性具有一定的抑制作用。
[0015] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 本發(fā)明所獲得的P. telluritireducens 16098氨肽酶重組蛋白在28 °C、 pH 7. 2時(shí)，對(duì)L-亮氨酸7-氨基-4-甲基香豆素具有顯著的氨肽酶活性，其Km值為 44. 56±5. 09 μπιο? L-1。重組蛋白最適溫度為28°C -40°C，在50°C以上熱穩(wěn)定性較低；最適 pH為7. 2-8. 0,且在pH 9. 0-12. 2時(shí)可檢測(cè)到活性；重組蛋白可耐受高鹽濃度及部分金屬離 子，但低鹽濃度及Cu2+、Zn2+和Cd2+等金屬離子可顯著抑制重組蛋白活性，EDTA、蛋白酶抑制 劑等亦對(duì)重組蛋白的活性具有一定的抑制作用?？梢?jiàn)本發(fā)明獲得的重組蛋白可用于將氨基 酸從蛋白或多肽的N末端解離，在蛋白降解方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的P. telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽編碼區(qū)體 外原核重組表達(dá)（A)和純化（B)圖。
[0018] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的重組P. telluritireducensl6098氨肽酶的米氏方程 曲線圖。
[0019] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的溫度對(duì)重組P. telluritireducensl6098氨肽酶活性 的影響圖。
[0020] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的重組P. telluritireducensl6098氨肽酶的熱穩(wěn)定性 圖。
[0021] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的pH對(duì)P. telluritireducens 16098氨肽酶活性的影 響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面的實(shí)驗(yàn)例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。
[0023] 本發(fā)明是通過(guò)PCR技術(shù)克隆獲得了 P. telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽的 編碼區(qū)序列，克隆到pET-30a(+)表達(dá)載體中，在大腸桿菌Transetta (DE3)中實(shí)現(xiàn)原核體外 重組表達(dá)。經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠純化獲得的重組蛋白分子。
[0024] 本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)獲得了 P. telluritireducens 16098氨肽酶 重組蛋白，其在28°C、pH 7.2時(shí)，對(duì)底物L(fēng)-亮氨酸7-氨基-4-甲基香豆素的Km值為 44.56±5.09以111〇1171;最適溫度為28°〇-40°〇，最適口!1為7.2-8.0，在？!19.0-12.2時(shí)仍 可檢測(cè)到活性；可耐受高鹽濃度及部分金屬離子，低鹽濃度、Cu2+、Zn2+和Cd2+等金屬離子以 及EDTA、蛋白酶抑制劑等對(duì)重組蛋白活性具有顯著抑制作用。本發(fā)明獲得的重組蛋白可用 于將氨基酸從多肽鏈的N-末端解離，在蛋白消化等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0025] 實(shí)驗(yàn)例I :P. telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽編碼區(qū)體外原核重組表達(dá) 和純化
[0026] 1、重組載體的構(gòu)建
[0027] 本發(fā)明中采用的重組載體為Novagen公司的pET_30a(+)原核表達(dá)載體。通過(guò)PCR 技術(shù)，采用5'末端分別添加了 Nde I和Xho I限制性酶切位點(diǎn)的引物Pl (5' -CATATGAA CGCGATTGATCAAAACTCAT-3'）和 P2(5' -CTCGAGTTAITTATCAAATAAAGCGTC-3'）擴(kuò)增來(lái)自深海 熱液口的假交替單胞菌P. telluritireducens 16098氨肽酶成熟肽的編碼區(qū)。反應(yīng)條件 為：首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)：94°C變性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸 2分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。用膠回收純化試劑盒（大連寶生物工程 有限公司）將擴(kuò)增片段純化回收，與PMD19-T載體連接。轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒， 并使用Nde I和Xho I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切；回收目的片段，并經(jīng)Nde I和Xho I酶切的表達(dá) 載體pET-30a(+)連接，完成重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0028] 2、重組蛋白的表達(dá)
[0029] 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌大腸桿菌Transetta(DE3)中，并篩選陽(yáng)性 克隆，測(cè)序確認(rèn)表達(dá)框的正確性。挑取單克隆，接種于200mL的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm， 37°C培養(yǎng)至OD 600 = 0. 4~0.8。加入IPTG(終濃度lmmol Γ1)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后于 4°C 5000rpm離心10分鐘，收集菌體，于-80°C凍存?zhèn)溆?。取Iml菌液離心，棄去上清后，加 入80 μ 1水和20 μ 1的5X蛋白上樣緩沖液，KKTC煮沸10分鐘，稍離心，SDS-PAGE檢測(cè)表 達(dá)產(chǎn)物。
[0030] 3、重組蛋白的純化
[0031] 本發(fā)明中重組蛋白在非變性條件下采用鎳瓊脂糖凝膠FF柱純化，即獲得來(lái)自深 海熱液口的假交替單胞菌Ρ. telluritireducens 16098氨肽酶重組蛋白。具體操作步驟如 下：
[0032] (1)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱（I. 6 X 20cm)，柱床體積為IOml ;
[0033] (2)用緩沖液 I (50mmol T1Tris-HCLO. 5mol T1NaCLpH 7. 2)平衡 2-5個(gè)床體積， 流速為2ml mirT1;
[0034] (3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞，用緩沖液I重懸，150瓦超聲破碎30分鐘，12000rpm， 4°C離心30分鐘，上清液用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾后，過(guò)柱，流速為Iml HiirT1;
[0035] (4)用緩沖液I再洗2-5個(gè)床體積，流速為2ml miiT1;
[0036] (5)用含有50mmol Γ1咪唑的緩沖液I再洗2-5個(gè)柱床體積，流速為2ml min
[0037] (6)依次用含有IOOmmol L'200mmol Γ1和400mmol廠1咪唑的緩沖液I洗脫目 的蛋白，流速為2ml mirT1;
[0038] (7)收集的蛋白在緩沖液 II (20mmol L-1Tris-HCl，400mmol T1NaCl, ρΗ7· 2)及去 離子水中透析，之后用SDS-PAGE檢測(cè)獲得的蛋白分子量和純度。純化蛋白凍干，存于-80°C 冰箱。
[0039] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：