一種苦參堿抑制人胰腺癌細(xì)胞遷移的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及苦參堿抑制人胰腺癌細(xì)胞迀移的分析方法的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]苦參堿是一種從苦參等豆科植物中提取出來的生物堿，被廣泛應(yīng)用于抗菌、抗病毒治療中。近幾年的研宄發(fā)現(xiàn)，苦參堿能顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。臨床工作中苦參堿已經(jīng)用于宮頸癌及白血病的治療。深入探討苦參堿藥理及生物學(xué)機(jī)制對于開發(fā)苦參堿臨床應(yīng)用具有重要意義。fct信號通路不僅在機(jī)體正常發(fā)育中具有重要作用，而且在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用。研宄發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展中均存在fct通路的異常活化?，F(xiàn)在研宄認(rèn)為fct/PCP通路與一些細(xì)胞極化、迀移及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子結(jié)合，在調(diào)節(jié)細(xì)胞迀移及浸潤中發(fā)揮重要作用。β -catenin是Wnt信號通路中重要的調(diào)節(jié)介質(zhì)，Wnt通路活化后，β -catenin進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)Wnt革巴基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞核內(nèi)β -catenin與Tcf_4形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)MTl-MMP的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞迀移與浸潤。在前期研宄中，我們發(fā)現(xiàn)苦參堿能抑制腫瘤細(xì)胞迀移、浸潤及轉(zhuǎn)移。但具體機(jī)制不明?？鄥A抑制腫瘤細(xì)胞迀移是否與調(diào)節(jié)Wnt通路活性有關(guān)，值得進(jìn)一步深入探討。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的就是解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，提出一種苦參堿抑制人胰腺癌細(xì)胞迀移的分析方法，采用該方法分析后能得知苦參堿作用一定時間能顯著降低人胰腺癌細(xì)胞的迀移與浸潤能力，人胰腺癌細(xì)胞迀移相關(guān)蛋白MTl-MMP及Wnt、β -Catenin表達(dá)明顯降低；進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)MTl-MMP轉(zhuǎn)錄活性也顯著降低，與Wnt信號通路活性一致，苦參堿通過調(diào)節(jié)Wnt通路活性，降低MTl-MMP的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，進(jìn)而抑制人胰腺癌細(xì)胞的迀移與浸潤。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了一種苦參堿抑制人胰腺癌細(xì)胞迀移的分析方法，其特征在于:依次包括以下步驟:
a)人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng):將人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于RPM1-1640培養(yǎng)基中，RPM1-1640培養(yǎng)基中含胎牛血清、生物活性為100 IU/mL的青霉素和生物活性為100 Pg/mL的鏈霉素，RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37° C，CO2體積濃度為5%培養(yǎng)箱中；
b)單層細(xì)胞迀移分析:將人胰腺癌細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24h，當(dāng)人胰腺癌細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上時，用200 μ I無菌Tip槍頭固定一個角度進(jìn)行劃痕，然后使用無菌PBS洗去人胰腺癌細(xì)胞碎片，再加入新鮮的RPM1-1640培養(yǎng)基，其中一組不加入苦參堿作為空白組，藥物處理組分別加入濃度為25 μ g/ml、50 μ g/ml苦參堿作用24_48h，最后通過倒置相差顯微鏡跟拍攝細(xì)胞遷移能力；
c)細(xì)胞浸潤分析:將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞按4X 14密度接種于細(xì)胞浸潤小室，細(xì)胞浸潤小室上部為含有2% FBS的的RPM1-1640完全培養(yǎng)基，細(xì)胞浸潤小室下部為含有10% FBS的RPM1-1640完全培養(yǎng)基，人胰腺癌細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育2h后，分別加入濃度為0μ/πι1、25μ/πι1、50μ/πι1的苦參堿處理并在培養(yǎng)箱中孵育10h，然后加入多聚甲醛室溫固定15min，使用無菌PBS洗三次后加入0.2%結(jié)晶紫染lOmin，去離子水沖洗干凈后置于倒置顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
d)酶聯(lián)免疫吸附分析:將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞按4X14密度接種于6孔板培養(yǎng)過夜后，分別加入濃度為O μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml的苦參堿處理并在培養(yǎng)箱中孵育24h，將人胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行裂解處理，收集人胰腺癌細(xì)胞上清液，分別采用MMP-9 ELISA試劑盒、MMP-2 ELISA試劑盒來檢測不同實(shí)驗(yàn)組中MMP-9和MMP-2的濃度；
e)免疫印跡分析:收集人胰腺癌細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑Cocktail，細(xì)胞裂解液由 50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% sodiumdeoxycholate, 5mM EDTA, 100 mM NaF, ImM Na3V04組成，在冰浴中裂解 30min，離心機(jī)離心30min后收集上清，通過BCA法測蛋白濃度并均衡各組蛋白，同等量細(xì)胞總蛋白用于12%SDS-PAGE電泳，蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜，室溫下添加5%脫脂奶粉后封閉lh，然后加入兔抗人wnt、β -catenin、MT 1-MMP,在4°C的溫度下孵育過夜，采用PBST緩沖液洗三次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育Ih，PBST緩沖液洗三次后，加入ECL超敏發(fā)光液，將PVDF膜進(jìn)行壓片、曝光、顯影及定影，圖像經(jīng)Image J軟件灰度掃描后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
[0005]本發(fā)明的有益效果:采用該方法分析后能得知苦參堿作用一定時間能顯著降低人胰腺癌細(xì)胞的迀移與浸潤能力，人胰腺癌細(xì)胞迀移相關(guān)蛋白MTl-MMP及Wnt、β -Catenin表達(dá)明顯降低；進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)MTl-MMP轉(zhuǎn)錄活性也顯著降低，與Wnt信號通路活性一致，苦參堿通過調(diào)節(jié)fct通路活性，降低MTl-MMP的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，進(jìn)而抑制人胰腺癌細(xì)胞的迀移與浸潤。
【具體實(shí)施方式】
[0006]本發(fā)明一種苦參堿抑制人胰腺癌細(xì)胞迀移的分析方法，其特征在于:依次包括以下步驟:
a)人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng):將人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于RPM1-1640培養(yǎng)基中，RPM1-1640培養(yǎng)基中含胎牛血清、生物活性為100 IU/mL的青霉素和生物活性為100 Pg/mL的鏈霉素，RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37° C，CO2體積濃度為5%培養(yǎng)箱中；
b)單層細(xì)胞迀移分析:將人胰腺癌細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24h，當(dāng)人胰腺癌細(xì)胞匯合度達(dá)90%以上時，用200 μ I無菌Tip槍頭固定一個角度進(jìn)行劃痕，然后使用無菌PBS洗去人胰腺癌細(xì)胞碎片，再加入新鮮的RPM1-1640培養(yǎng)基，其中一組不加入苦參堿作為空白組，藥物處理組分別加入濃度為25 μ g/ml、50 μ g/ml苦參堿作用24_48h，最后通過倒置相差顯微鏡跟拍攝細(xì)胞遷移能力；
c)細(xì)胞浸潤分析:將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞按4X 14密度接種于細(xì)胞浸潤小室，細(xì)胞浸潤小室上部為含有2% FBS的的RPM1-1640完全培養(yǎng)基，細(xì)胞浸潤小室下部為含有10% FBS的RPM1-1640完全培養(yǎng)基，人胰腺癌細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育2h后，分別加入濃度為0μ/πι1、25μ/πι1、50μ/πι1的苦參堿處理并在培養(yǎng)箱中孵育10h，然后加入多聚甲醛室溫固定15min，使用無菌PBS洗三次后加入0.2%結(jié)晶紫染lOmin，去離子水沖洗干凈后置于倒置顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；
d)酶聯(lián)免疫吸附分析:將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌細(xì)胞按4X14密度接種于6孔板培養(yǎng)過夜后，分別加入濃度為O μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml的苦參堿處理并在培養(yǎng)箱中孵育24h，將人胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行裂解處理，收集人胰腺癌細(xì)胞上清液，分別采用MMP-9 ELISA試劑盒、MMP-2 ELISA試劑盒來檢測不同實(shí)驗(yàn)組中MMP-9和MMP-2的濃度；
e)免疫印跡分析:收集人胰腺癌細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑Cocktail，在冰浴中裂解30min，離心機(jī)離心30min后收集上清，通過BCA法測蛋白濃度并均衡各組蛋白，同等量細(xì)胞總蛋白用于12% SDS-PAGE電泳，蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜，PVDF膜上室溫下添加5%脫脂奶粉后封閉lh，然后加入兔抗人wnt、β -catenin,MTl-MMP,在4°C的溫度下孵育過夜，采