人類aldh2基因多態(tài)性檢測特異性引物和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種人類ALDH2基因多態(tài)性檢測特異性 引物和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH)是一種催化乙醛以及其他脂肪 族醛氧化的四聯(lián)體蛋白酶。目前，已發(fā)現(xiàn)有19種ALDH同工酶，研宄較為深入的主要有胞 質(zhì)同工酶ALDHl和線粒體同工酶ALDH2,其中ALDH2在肝臟和胃中具有很高的表達(dá)量，是人 體乙醇代謝途徑中關(guān)鍵酶之一。
[0003] 人類ALDH2基因位于人類第12號染色體的12q24. 2,總長約44kb，含有13個(gè)外 顯子，編碼有517個(gè)氨基酸殘基的多肽，目前發(fā)現(xiàn)存在His47Arg、Glu479Lys、Glu504Lys 等多種突變體，其中主要突變體是Glu504Lys(rs671)，即位于12號外顯子的單堿基突變 G1510A。正常的等位基因記為ALDH2*1 (*1510G)，突變的等位基因記為ALDH2*2 (*1510A)。 ALDH2*2在人類各族群中的分布是不同的，研宄顯示中國人ALDH2*2的頻率為16 %，日本人 24%，泰國人5%，韓國人15%，印度人2%，但在白種人與黑人人群中頻率很低，甚至完全 缺乏。研宄顯示，突變型等位基因 ALDH2*2的乙醛脫氫酶活性及硝酸酯酶活性基本喪失。
[0004] ALDH2*2/*2純合突變型乙醛脫氫酶活性約為ALDH2*1野生型的2%，ALDH2*l/*2 雜合突變型乙醛脫氫酶活性約為ALDH2*1野生型的13-14%。突變型基因 ALDH2*2的存在與 酒精性中毒、酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD)、消化道癌癥等疾病有關(guān)。研宄 顯示，攜帶ALDH2*2突變基因型者大量飲酒將顯著增加患肝癌的危險(xiǎn)性。在飲酒人群中，尤 其是重度飲酒者，由于其上消化道長期地與大量酒精直接接觸，該區(qū)域出現(xiàn)癌變（食道癌、 口咽癌等）的幾率較高。此外，ALDH2*2顯性突變與胃癌的易感性也存在一定的聯(lián)系。研 宄顯示，ALDH2*2突變?nèi)巳夯几伟⑹车腊?、口腔癌的概率分別是ALDH2*1野生人群的3倍、 12. 95倍、11. 72倍以上。
[0005] ALDH2同時(shí)也是硝酸甘油有效代謝物NO形成的關(guān)鍵，ALDH2*2突變會導(dǎo)致硝酸酯 酶活性降低，使得硝酸甘油在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化過程受阻，有效活性產(chǎn)物NO生成減少，進(jìn)而導(dǎo) 致硝酸甘油治療心絞痛效果降低。研宄表明，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治療心絞痛 的療效明顯優(yōu)于ALDH2*2患者，野生型ALDH2對硝酸甘油的催化活性（Vmax/Km)大約是突 變型的10倍，且前者迅速起效率也明顯高于后者。ALDH2*2/*2純合突變型硝酸酯酶活性約 為ALDH2*1野生型的6-7%，ALDH2*l/*2雜合突變型硝酸酯酶活性約為ALDH2*1野生型的 8-15%。同時(shí)，ALDH2突變基因攜帶者服用硝酸甘油無效風(fēng)險(xiǎn)也在大幅增加，ALDH2純合及 雜合突變型使用無效率達(dá)到42. 4%，大約為ALDH2野生型的3倍。ALDH2基因多態(tài)性如表 1所示。
[0006] 表1 :ALDH2基因多態(tài)性
[0007]
[0008] 目前針對基因多態(tài)性的檢測方法很多，如直接測序法，焦磷酸測序法，高分辨率溶 解曲線檢測法（High Resolution Melting Analysis，HRM)，熒光定量PCR法等。其中最常 見方法為測序法，該方法費(fèi)用較低，但操作耗時(shí)長且靈敏度低；高分辨率溶解曲線法對設(shè)備 要求比較特殊，臨床推廣存在一定的困難；傳統(tǒng)熒光定量PCR法在臨床上應(yīng)用較為廣泛，但 該方法檢測基因多態(tài)性一般采用Genotyping方法進(jìn)行檢測，該方法對樣本數(shù)量以及多態(tài) 性分布有一定要求，樣本量少時(shí)不能對樣本基因多態(tài)性進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。因此，需要建立一種 快速有效的檢測少量樣本的ALDH2基因多態(tài)性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種人類ALDH2基因多 態(tài)性檢測特異性引物和試劑盒，以此解決現(xiàn)有基因多態(tài)性檢測技術(shù)中，樣本量少時(shí)基因多 態(tài)性檢測效果不理想的問題。
[0010] 本發(fā)明提供了一種人類ALDH2基因多態(tài)性檢測特異性引物，其中，正向引物的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種人類ALDH2基因多態(tài)性檢測試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明 所述的特異性引物。
[0012] 所述試劑盒還包括一組如SEQ ID NO. 3與SEQ ID NO. 4熒光定量PCR探針序列， 且所述熒光定量PCR探針的5'端有FAM或VIC修飾，3'端有NFQ-MGB修飾。
[0013] 試劑盒采用Taqman探針法，建立了在同一反應(yīng)管檢測同一基因兩種不同多態(tài)性 的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法，通過能特異性識別野生型和突變型模板的探針序列，有效 區(qū)分同一基因的兩種多態(tài)性，同時(shí)引入內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)和UNG酶防污染系統(tǒng)，能更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定地 對樣品進(jìn)行分型檢測。本發(fā)明的試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.可以準(zhǔn)確檢測單個(gè)樣品的基因 型；2.可以準(zhǔn)確檢測Ing基因組DNA的基因型；3.針對ALDH2的基因型設(shè)計(jì)SNP分型探針， 可以特異性擴(kuò)增識別對應(yīng)基因的多態(tài)性；4.使用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，檢測過程均 為閉管反應(yīng)，顯著降低污染，并且加入U(xiǎn)NG酶防污染系統(tǒng)，確保結(jié)果真實(shí)可信；5.在同一反 應(yīng)管中檢測同一基因兩種多態(tài)性，操作簡便，能在90分鐘內(nèi)完成檢測，且結(jié)果判讀方法簡 單客觀，便于分析。
【附圖說明】
[0014] 圖1為ALDH2*1/*1純合野生樣本43例檢測結(jié)果；
[0015] 圖2為ALDH2*l/*2雜合突變樣本16例檢測結(jié)果；
[0016] 圖3為ALDH2*2/*2純合突變樣本1例檢測結(jié)果；
[0017] 圖4為ALDH2*1/*1純合野生樣本40例檢測結(jié)果；
[0018] 圖5為ALDH2*l/*2雜合突變樣本9例檢測結(jié)果；
[0019] 圖6為ALDH2*2/*2純合突變樣本1例檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合 附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施僅僅用以 解釋本發(fā)明，并不限定本發(fā)明。
[0021] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種人類ALDH2基因多態(tài)性檢測特異性引物，其中，正 向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種用于人類ALDH2基因多態(tài)性的檢測試劑盒，該試劑盒包括 PCR緩沖液，1組特異性引物，1組熒光定量PCR探針和內(nèi)標(biāo)系統(tǒng)，Hot Start Taq酶，UNG酶。
[0023] 所述特異性引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，反向引物的核苷 酸序列如SEQ ID No. 2所示。擴(kuò)增包含ALDH2*1和ALDH2*2基因多態(tài)性的DNA片段。
[0024] ALDH2*1 上游引物 5' -TTGGAGCCCAGTCAC-3' SEQ ID N0:1
[0025] ALDH2*2 下游引物 5' -CCTCAAGCCCCAAC-3' SEQ ID N0:2
[0026] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述PCR緩沖液中含有1. 0~5. OmM的MgCl2,1. 0~ 5. OmM 的 dNTPs，即 dATP、dUTP、dGTP 和 dCTP 各 L 0 ~5. OmM。
[0027] 所述熒光定量PCR探針5'端修飾有FAM或VIC，3'端修飾有非熒光淬滅基團(tuán) NFQ(Non-Fluorescent Quencher)，該基團(tuán)本身不產(chǎn)生焚光，因此可以大大降低本底信號的 強(qiáng)度，同時(shí)該熒光定量PCR探針上還連接有MGB修飾基團(tuán)，可以將該探針的Tm值提高10°C 左右，因此同樣的Tm值，MGB探針可以比普通Taqman探針設(shè)計(jì)的更短，使得探針在識別具 有單個(gè)核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)時(shí)，特異性更強(qiáng)。
[0028] 優(yōu)選地，所述熒光定量PCR探針的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3與SEQ ID NO. 4所 示，SEQ ID NO. 3特異性檢測ALDH2*1的模板DNA ;