用于檢測(cè)生物樣本中bmp3和ndrg4甲基化水平的引物和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)及診斷研宄領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)生物樣本中BMP3和 NDRG4甲基化水平的引物和探針，及利用該引物和探針檢測(cè)樣品中BMP3和NDRG4甲基化水 平，以提供用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷的信息。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌也被稱為大腸癌，發(fā)生在結(jié)腸（大腸）或直腸中，通常發(fā)展緩慢，是中國(guó) 城鎮(zhèn)第二高發(fā)癌癥，40歲以上無(wú)癥狀人群中6%患有早期腸癌。隨著食品結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣 的改變，以及環(huán)境問(wèn)題的日益突出，導(dǎo)致大腸癌發(fā)生率快速增長(zhǎng)，據(jù)《中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》報(bào) 道顯示，腸癌是目前中國(guó)城市發(fā)病率僅次于肺癌的第二大癌癥，主要包括結(jié)腸癌與直腸癌 兩大類。目前我國(guó)每年新增結(jié)直腸癌確診病例44萬(wàn)例，每年死亡患者多達(dá)23萬(wàn)人。國(guó)家 癌癥早診早治項(xiàng)目專家委員會(huì)2013年研宄報(bào)告指出，中國(guó)40歲以上高危人群患進(jìn)展期腺 瘤和早期腸癌比率為6 %。這些癌變病灶不及時(shí)切除，90 %的情況下將會(huì)轉(zhuǎn)化為惡性腸癌。 由于大部分患者在早期并未發(fā)現(xiàn)重視并得到及時(shí)治療，腸癌死亡率居高不下。如果將腸癌 早期篩查技術(shù)在中國(guó)進(jìn)行普及推廣，預(yù)計(jì)結(jié)直腸癌死亡率可從現(xiàn)有水平降低50 %以上。
[0003] 篩查是在未出現(xiàn)疾病癥狀的人群中尋找并確診患者。目前篩查主要有以下幾類： (1)常規(guī)血檢類，特異性敏感性不強(qiáng)，對(duì)身體有創(chuàng)傷性；（2)影像學(xué)類，如腸鏡檢查，軟式乙 狀結(jié)腸鏡，CT結(jié)腸成像（虛擬腸鏡檢查），雙對(duì)比鋇灌腸（DCBE)等，此類方法需要檢查 前藥物清腸、麻醉等處理，對(duì)身體創(chuàng)傷性比較嚴(yán)重；（3)糞便潛血檢測(cè)類，如糞便隱血試驗(yàn) (FOBT)，糞便免疫化學(xué)試驗(yàn)（FIT)等，方便無(wú)創(chuàng)但特異性敏感性不強(qiáng)。同時(shí)，以上方法均需 要到醫(yī)院實(shí)施，處理周期長(zhǎng)，或者費(fèi)用較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)上述缺點(diǎn)，提供了一種用于檢測(cè)生物樣本中BMP3和NDRG4甲基化水平 的引物和探針，通過(guò)取病人的生物樣本，采用熒光實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)技術(shù)，達(dá)到快速敏捷地檢測(cè) 出BMP3和NDRG4甲基化水平，以達(dá)到高靈敏和特異性提供用于結(jié)直腸腫瘤早期診斷的信 息，為結(jié)直腸腫瘤早發(fā)現(xiàn)提供一個(gè)簡(jiǎn)便易行的解決方案的目的。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0006] 本發(fā)明人體生物樣本包括組織、細(xì)胞、血液、分泌物和排泄物；其中排泄物為糞便。 采用本發(fā)明的引物和探針可檢測(cè)上述各種生物樣本，基于無(wú)侵入性和低廉方便考慮，優(yōu)選 糞便樣本。
[0007] 用于檢測(cè)生物樣本中BMP3和NDRG4甲基化水平的引物，包括正向引物，一條選自 (A)組的正向引物和一條選自⑶組的正向引物；
[0008] (A)BMP3 正向引物
[0009] GTTTAATTTTCGGTTTCGTCGTC (SEQ ID NO ：1)
[0010] AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO ：2)
[0011] AATATTCGGGTTATATACGTCGCGA(SEQ ID NO ：3)
[0012] AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO ：4)
[0013] TTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGT(SEQ ID NO ：5)
[0014] GAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO ：6)
[0015] TGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO ：7)
[0016] TTAGGTTGCGTTGGGTTAGCG(SEQ ID NO ：8)
[0017] TTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTG(SEQ ID NO ：9)
[0018] GGTGAGGTTCGCGTAGTTGTTG(SEQ ID NO ：10)
[0019] GTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGG(SEQ ID NO ：11)
[0020] AATATTCGGGTTTATACGTCGC(SEQ ID NO ：12)
[0021] AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO ：13)
[0022] GAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO :14)
[0023] AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO ：15)
[0024] AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO ：16)
[0025] AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO ：17)
[0026] AATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO ：18)
[0027] TATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO： 19)
[0028] TTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTYGY(SEQ ID NO ：20)
[0029] TTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO ：21)
[0030] TTTGAAAATATTTGGGTTATATACGTTGC(SEQ ID NO ：22)
[0031] TTTGAAAATATTCGGGTTATATACGTTGC(SEQ ID NO ：23)
[0032] TTTGAAAATATTTGGGTTATATACGTCGC(SEQ ID NO ：24)
[0033] TTTGAAAATATTYGGGTTATATACGTYGC(SEQ ID NO ：25)
[0034] AATATTCGGGTTATATACGTCGCGATT(SEQ ID NO ：26)
[0035] AGGAGGGAAGGTATAGATAGATTTTGAA(SEQ ID NO ：27)
[0036] GAGTGGAGACGGCGTTCGTA(SEQ ID NO ：28)
[0037] GGAGTGGAGACGGCGTTC(SEQ ID NO ：29)
[0038] GAGTGGAGACGGCGTTC(SEQ ID NO ：30)
[0039] GGCGTTCGTAGCGTTTTGC(SEQ ID NO ：31)
[0040] GCGTTCGTAGCGTTTTGC(SEQ ID NO ：32)
[0041] TTTGGAGTTTAATTTTCGGTTTC(SEQ ID NO ：33)
[0042] AGTGGGGTTGGTCGTTATTTC(SEQ ID NO ：34)
[0043] TTGAAAATATTTGGGTTATATATGTTGT(SEQ ID NO ：35)
[0044] TGGAGTGGAGATGGTGTTTGT(SEQ ID NO ：36)
[0045] TTGTTAGGTTGTGTTGGGTTAGTG(SEQ ID NO ：37)
[0046] GTGAGGTTTGTGTAGTTGTTGGG(SEQ ID NO ：38)
[0047] (B)NDRG4 正向引物
[0048] CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG(SEQ ID NO ：39)
[0049] CGAAACTTCAACGCCGCCGAC(SEQ ID NO ：40)
[0050] GTACGTGGAGGGGTTTTTGGTTG(SEQ ID NO ：41)
[0051] CGCGCAAACAAAAAACGAAACTTCGA (SEQ ID NO ：42)
[0052] GAGTGGGTGAGAAGTCGGTGGGG(SEQ ID NO ：43)
[0053] GGCGGAGTGGGTGAGAAGTCG(SEQ ID NO ：44)
[0054] GGGTTTTTGGTTGTTCGTATTTGTATT(SEQ ID NO ：45)
[0055] CGGTTTTCGTTTTTGTAGTCGCGGGT(SEQ ID NO ：46)
[0056] GCGGAGGGGTTTTTGGTTGTTCG(SEQ ID NO ：47)
[0057] GCGGGTGAGAAGTCGGC(SEQ ID NO ：48)
[0058] CGGAGCGGGTGAGAAGTC(SEQ ID NO ：49)
[0059] CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGT(SEQ ID NO ：50)
[0060] CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG(SEQ ID NO ：51)
[0061] ATYGATYGGGGTGTTTTTTAGGTTTY(SEQ ID NO ：52)
[0062] ATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTC (SEQ ID NO ：53)
[0063] ATCGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTT(SEQ ID NO ：54)
[0064] ATCGATTGGGGTGTTTTTTAGGTTTC(SEQ ID NO ：55)
[0065] ATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTT(SEQ ID NO ：56)
[0066] GGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTC(SEQ ID NO ：57)；
[0067] 和反向引物，一條選自（C)組的反向引物和一條選自（D)組的反向引物；
[0068] (OBMP3反向引物
[0069] CTCCCGACGTCGCTACG(SEQ ID NO ：58)
[0070] CCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO ：59)
[0071] CGCGAACCTCACCCGCGCAA (SEQ ID NO ：60)
[0072] CCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO ：61)
[0073] ACCTCACCCACACAAAACACT(SEQ ID NO ：62)
[0074] CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO ：63)
[0075] CCACTTACTACACTAACCCAACAC(SEQ ID NO ：64)
[0076] ACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO ：65)
[0077] AACACTCCAAAAACACAAAAAACC(SEQ ID NO ：66)
[0078] CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO ：67)
[0079] ACACTCCAAAAACACAAAAAACCAAC(SEQ ID NO ：68)
[0080] CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO ：69)
[0081] CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO ：70)
[0082] CCACTTACTACGCTAACCCAACG(SEQ ID NO ：71)
[0083] CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO ：72)
[0084] CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO ：73)
[0085] CACTCCGAAAACGCAAAAAACCG(SEQ ID NO ：74)
[0086] CCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO ：75)
[0087] ACCTCACCCGCGCAAAACG(SEQ ID NO ：76)
[0088] ATAAACTCTTCCCCAACAACTACRCRAA(SEQ ID NO ：77)
[0089] ATAAACTCTTCCCCAACAACTACGCGAA(SEQ ID NO ：78)
[0090] ATAAACTCTTCCCCAACAACTACACAAA(SEQ ID NO ：79)
[0091] ATAAACTCTTCCCCAACAACTACACGAA(SEQ ID NO ：80)
[0092] ATAAACTCTTCCCCAACAACTACGCAAA(SEQ ID NO ：81)
[0093] GCAACCTAACAAATAAACTCTTCCCCAA(SEQ ID NO ：82)
[0094] AACAAATAAACTCTTCCCCAACAACTAC(SEQ ID NO ：83)
[0095] CCACTTACTAC