一種分離純化仙鶴草中間苯三酚類化合物的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及天然有機化學領域，具體涉及一種分離純化仙鶴草中間苯三酚類化合物的方法。
【背景技術】
[0002]仙鶴草，為薔薇科植物龍牙草(Agrimonia polosa Ledeb)的干燥地上部分，具有收斂止血、截瘧、止痢、解毒、補虛等功能，用于治療咯血、吐血，崩漏下血，瘧疾，血痢，癰腫瘡毒，陰癢帶下，脫力勞傷等。現(xiàn)代藥理研宄發(fā)現(xiàn)仙鶴草有抗腫瘤、降血糖、降血壓、抗氧化等多種活性，是一種對人類有顯著保健作用的天然藥材。
[0003]仙鶴草全草含有多種化學成分，如仙鶴草素、鞣酸、揮發(fā)油、留醇、有機酸、酚類、黃酮類和糖苷類等。目前，人們已嘗試運用不同的技術手段對其化學成分進行了分離和鑒定，然而酚類結構的化合物(尤其是間苯三酚類化合物)，其分離純化的方法還是以傳統(tǒng)的柱色譜技術為主，例如在《仙鶴草地上部分仙鶴草酚B的分離與鑒定》一文中應用硅膠及Sephadex LH-20柱色譜技術對仙鶴草石油醚提取物進行分離純化，用石油醚、氯仿洗脫，結果分離鑒定了一個丁酰基間苯三酚類化合物，即仙鶴草酚B (賀成、秦文杰、唐曉晶、陳玉武、葉祖光，《中草藥》，2011年第2期255-256頁)；又例如在《HPLC法測定仙鶴草中鶴草酚含量及鶴草酚結構的2DNMR分析研宄》一文中通過溶劑提取及硅膠柱色譜反復分離，制備薄層，Sephadex LH-20以及多次重結晶手段，從仙鶴草根芽的95%乙醇提取物分離得到了鶴草酚、仙鶴草酚B、偽綿馬素這三個間苯三酚類化合物(杜超，沈陽藥科大學0)]，2008年)。上述分離技術的缺陷之處在于:①由于間苯三酚類化合物在仙鶴草中含量低、極性弱，采用傳統(tǒng)的柱色譜技術對間苯三酚類樣品分離時會產(chǎn)生有較強吸附，導致樣品大量損失，收率降低；?分離步驟繁瑣，需要多種柱色譜聯(lián)用，如硅膠、凝膠柱等，洗脫劑采用大量有機溶劑，不但分離效率低，而且不夠安全、環(huán)保、經(jīng)濟。
[0004]高速逆流色譜(High-SpeedCounter Current Chromatography, HSCCC)是一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術，利用樣品在互不相溶的兩相中的分配能力不同，使得各組分得以分離。因其兩相均為液體，能夠很好地克服傳統(tǒng)分離技術的缺點，可避免樣品的不可逆吸附、失活、變性等問題，且具有一次性制備量大、產(chǎn)物得率較高、儀器操作簡易并運行成本低等優(yōu)點。HSCCC溶劑體系按極性通常分為強極性、中等極性、弱極性和無水體系，前三者均為含水體系，而無水體系是指純有機相構成的兩相溶劑體系；含水體系是目前常用的用于分離天然產(chǎn)物的HSCCC溶劑體系。
[0005]經(jīng)檢索，目前有兩篇專利文獻采用了 HSCCC分離仙鶴草中的成分。其中一篇是公開號為CN101775028的中國發(fā)明專利，公開了一種富集純化仙鶴草素的方法，其特點是采用高速逆流色譜含水的強極性體系和中等極性體系從仙鶴草70%丙酮浸提液中，經(jīng)過兩次HSCCC分離得到98%純度的仙鶴草素。該專利與本發(fā)明的差異之處在于:①目標化合物的結構和極性差距大。該專利分到的仙鶴草素是個極性較大的化合物，本發(fā)明分到的間苯三酚二縮合體為極性非常弱的化合物；②溶劑體系的區(qū)別。該專利采用脂肪脂、脂肪醇及水為溶劑體系，適合分離中等或強極性的化合物，不適于極性很弱的化合物，本發(fā)明的化合物由于極性非常弱，在水相中保留率低，所以會導致目標物質在水相中因無保留而無法分離。
[0006]另一篇是公開號為CN102329206的中國發(fā)明專利，公開了一種鶴草酚的制備方法，方法是:1)取仙鶴草藥材粉碎，加5-10倍量60-90%乙醇溶液回流提取2-3次，提取液加活性炭脫色，過濾濃縮，濃縮液用氯仿萃取，萃取液回收試劑，得粗提物；2)將上述粗提物采用高速逆流色譜含水體系分離，紫外檢測器監(jiān)測，根據(jù)圖譜收集目標成分，流分減壓回收試劑，干燥即得高純度鶴草酚。該專利與本發(fā)明的差異之處在于:①目標化合物的極性差距較大。鶴草酚為單苯環(huán)結構，且含不飽和六元環(huán)酮，因此極性也較仙鶴草中其他的間苯三酚類化合物大鶴草酚可以采用常規(guī)的含水體系進行分離，但仙鶴草中石油醚提取出來的極性較鶴草酚弱的間苯三酚類化合物無法用含水體系分離獲得。
[0007]我們知道，仙鶴草中的間苯三酚類化合物多為間苯三酚二縮合體以及間苯三酚三縮合體，而且同系物和同分異構體較多，該類化合物極性很弱(鶴草酚除外)，采用HSCCC常規(guī)溶劑體系不能達到分離的目的，是天然產(chǎn)物分離中的一大技術難題。因此，綜上所述，采用何種方法，能夠同時高效地分離得到低極性的間苯三酚類化合物尤其是本發(fā)明所涉及的間苯三酚二縮合體化合物，是本領域技術人員急需解決的技術難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供了一種分離純化仙鶴草中極性極弱的間苯三酚類化合物的方法，實現(xiàn)快速、高效、環(huán)保地分離，以解決現(xiàn)有技術存在的上述缺陷。
[0009]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明以仙鶴草提取物作為分離對象，采用薄層色譜篩選溶劑體系，并用高速逆流色譜無水溶劑體系法分離純化，得到兩個間苯三酚化合物，經(jīng)鑒定為偽綿馬素(pseudo-aspidin)、a -Kosin0
[0010]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:
[0011]一種分離純化仙鶴草中間苯三酚類化合物的方法，取仙鶴草粗提物，先后經(jīng)過兩次高速逆流色譜法純化處理，得到間苯三酚類化合物，其中:
[0012](I)第一次高速逆流色譜法分離純化
[0013]采用由溶劑Α、溶劑B、溶劑C組成的溶劑體系，各組分的體積比為A:B:C = (10?12): (0.5?I): (O?0.5)，混合均勻，靜置分層，分液得到上下兩相溶液；以上相為固定相，下相為流動相，先將固定相填滿逆流色譜分離柱，再泵入流動相，取仙鶴草粗提物用兩相溶液溶解后進樣，按梯度時間間隔分管收集洗脫液，分段合并，回收溶劑，得間苯三酚類化合物的混合物；
[0014](2)第二次高速逆流色譜法分離純化
[0015]采用由溶劑D、溶劑B、溶劑E組成的溶劑體系，各組分的體積比為D:B:E =10:7:3，混合均勻，靜置分層，分液得到上下兩相溶液；以上相為固定相，下相為流動相，先將固定相填滿逆流色譜分離柱，再泵入流動相，并將流動相的出液口與進液口連通以形成閉合回路；取步驟(I)分離得到的混合物用兩相溶液溶解后進樣，循環(huán)洗脫，直至分離得到間苯三酚類化合物的單體；
[0016]溶劑A為正己烷、環(huán)己烷、正庚烷、石油醚、乙腈中的一種或幾種；溶劑B為二氯甲烷、三氯甲烷中的一種或幾種；溶劑C為甲醇、乙醇中的一種或幾種；溶劑D為正己烷；溶劑E為乙腈。
[0017]優(yōu)選的，步驟(2)中高速逆流色譜采用閉合回路循環(huán)的次數(shù)為7次。
[0018]優(yōu)選的，步驟⑴中的仙鶴草粗提物，由如下方法制得:將仙鶴草粉末用石油醚回流提取，過濾，合并濾液，回收溶劑，殘渣經(jīng)溶劑萃取后，濃縮，即得。
[0019]更優(yōu)選的，仙鶴草粗提物的制備方法中，提取溶劑選用石油醚60?90°C ;萃取溶劑選用氯仿、5 %氫氧化鈉中的一種或幾種。
[0020]優(yōu)選的，兩次高速逆流色譜法的分離條件為:柱溫10?20 °C，轉速700?lOOOrpm，優(yōu)選800?900rpm，流動相的流速為2?5mL/min，檢測波長為285nm。
[0021]優(yōu)選的，溶劑A為體積比為1:1的正己烷與乙腈的混合液或體積比為1:1的石油醚與乙腈的混合液，溶劑B為二氯甲烷，溶劑C為甲醇。
[0022]更優(yōu)選的，第一次高速逆流色譜的溶劑體系由體積比為6:6:0.5:0.5的正己烷、乙腈、二氯甲烷、甲醇組成，第二次高速逆流色譜的溶劑體系由體積比為10:7:3的正己烷、
二氯甲烷、乙腈組成。
[0023]更優(yōu)選的，第一次高速逆流色譜的溶劑體系由體積比為5:5:0.5的正己烷、乙腈、二氯甲烷組成，第二次高速逆流色譜的溶劑體系由體積比為10:7:3的正己烷、二氯甲烷、乙腈組成。
[0024]更優(yōu)選的，第一次高速逆流色譜的溶劑體系由體積比為6:6:0.5:0.5的石油醚、乙腈、二氯甲烷、甲醇組成，第二次高速逆流色譜的溶劑體系由體積比為10:7:3的正己烷、
二氯甲烷、乙腈組成。
[0025]更優(yōu)選的，第一次