以三氟乙胺基為p2-p3連接基團的肼腈類組織蛋白酶k抑制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織蛋白酶K抑制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以三氟乙胺基為P2-P3 連接基團的、具有不同P3位基團的針對組織蛋白酶K的肼腈類抑制劑及其在制備抗骨質(zhì)疏 松癥藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人體骨骼的成分主要包括骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)，骨礦物質(zhì)主要是羥磷灰石，骨基質(zhì) 則包括I型膠原蛋白、骨橋接素和骨連接素等，其中以占骨基質(zhì)成分95%以上的I型膠原 蛋白為主。骨骼是人體的重要器官，具有運動、支持和保護身體的作用。正常的骨骼代謝 維系著人體的骨健康，而異常的骨骼代謝給人們帶來了疾病和痛苦。骨代謝過程通常受骨 形成和骨吸收兩個對立且統(tǒng)一的過程調(diào)控，二者的動態(tài)平衡為骨的正常生理代謝提供了基 礎(chǔ)。骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis)就是由二者的動態(tài)失衡[1]，骨吸收強于骨形成，導(dǎo)致的骨 量減少和骨組織微觀結(jié)構(gòu)的退化，以及骨脆性和骨折風險顯著增加的骨疾病[2'3]。
[0003] 組織蛋白酶K(Cath印sin K，Cat K)是一種由CTSK基因控制表達、與骨質(zhì)疏松癥 密切相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶[4]，其主要功能為水解膠原蛋白。Cat K是目前已知的唯一一 個既能夠切斷膠原蛋白中穿插于三鏈間的三重螺旋又能夠切割膠原蛋白N-和C-端肽區(qū)域 (N-and C-telopeptide regions)的哺乳動物膠原蛋白酶[2'4'5]，其水解膠原蛋白的能力可 以與細菌的膠原蛋白酶（bacterial collagenases)相媲美[6]。Cat K能夠?qū)⒛z原纖維水解 成小的肽鏈段，通過切割膠原蛋白N-和C-端肽區(qū)域，釋放交聯(lián)的N-或C-端肽，這些端肽 在尿中或者血清中的定量檢測已經(jīng)被用作標志性分子標定體內(nèi)的骨吸收情況。同時，Cat K 還能降解骨基質(zhì)的其它成分（如骨橋接素和骨連接素等）[7]。因而，Cat K是骨吸收過程中 極其重要的水解蛋白，在骨吸收過程起著重要的調(diào)節(jié)作用，其過量表達可引起骨質(zhì)疏松癥。 因此，Cat K已經(jīng)成為治療骨質(zhì)疏松癥的重要靶點[8'9]。用抑制劑適當降低和抑制體內(nèi)Cat K的溶骨活性，可以減少骨流失，維持骨質(zhì)疏松癥患者體內(nèi)骨代謝的平衡，對治療骨質(zhì)疏松 癥會十分有效。
[0004] 文獻報道過一系列肼腈類抑制劑，其P2位基團為異丁基，P3位基團為一元環(huán)、二 元環(huán)和三元環(huán)等大小不同的芳基結(jié)構(gòu)。通過體外酶活測試發(fā)現(xiàn)，該系列抑制劑具有極強的 抑制效果，對組織蛋白酶K具有非常高的抑制性能（抑制常數(shù)1在皮摩爾（KT12M)到亞納 摩爾（KTkiM))級別[1°]。但該類抑制劑也存在一些缺點：抑制劑對Cat K相對于組織蛋白酶 L(Cathepsin L，Cat L)、組織蛋白酶B(Cathepsin B，Cat B)和組織蛋白酶S(Cathepsin S， Cat S)的選擇性不高（約1-10倍），尤其是對Cat L的選擇性較差。此外，由于該類抑制 劑屬于擬肽類分子，在體內(nèi)可能會被蛋白酶或肽酶水解，有潛在的代謝不穩(wěn)定的缺點[11]。
[0005] 抑制劑的P2-P3連接基團（P2-P31inker)是介于化合物P2基團和P3基團之間的 連接部分。曾有研宄報道，不同的P2-P3連接基團對抑制劑的抑制常數(shù)有較大影響。P2-P3 連接基團可通過自身的構(gòu)型影響其兩側(cè)基團的伸展和取向，進而影響抑制劑在酶活性位點 附近的排布。此外，P2-P3連接基團自身還會與靶標蛋白酶作用，與酶形成一些如氫鍵、疏水 相互作用等非共價相互作用力，進而影響抑制劑對靶標蛋白酶的結(jié)合力和識別選擇性。因 此，P2-P3連接基團能夠影響抑制劑整體的功能與性質(zhì)。
[0006] McGrath等人曾在2003年報道過一個二肽類抑制劑，該抑制劑的P2-P3連接基團 是酰胺鍵。他們通過X-光晶體學研宄了該抑制劑和Cat K形成的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) 該抑制劑P2-P3連接基團的酰胺鍵與Cat K之間存在氫鍵作用。酰胺鍵中，作為氫鍵給體 的仲胺基（-NH-，secondary amine)和Cat K的Gly66殘基形成氫鍵，進而增加了抑制劑和 酶之間的相互作用力；而作為氫鍵受體的羰基伸向了溶劑，沒有與酶形成氫鍵作用[12]。對 于以酰胺鍵為P2-P3連接基團的抑制劑分子，酰胺鍵的仲胺基具有增強抑制劑和酶之間結(jié) 合力的作用，而羰基則無此作用。因此，為了探索設(shè)計性能更好的抑制劑，可以在保留氫鍵 給體性質(zhì)的前提下用其它基團來代替抑制劑分子的P2-P3連接基團一一酰胺鍵。
[0007] 另外，酰胺鍵中的仲氨基具有一定的堿性，而Cat K的生成和工作環(huán)境是偏酸性 的。在生物體內(nèi)，抑制劑要發(fā)揮對Cat K的抑制作用，必定要進入到Cat K所在的酸性 環(huán)境中。堿性的氨基在酸性條件下，易于形成按離子（NH2+，ammoniumion)，但按離子需要 經(jīng)過去溶劑化作用（desolvation)才能進入酶的活性位點內(nèi)，此過程需要消耗抑制劑和 酶的部分結(jié)合能，對抑制劑與酶的結(jié)合不利[13]。此外，堿性的抑制劑具有趨溶酶體效應(yīng) (Iysosomotropism)，即抑制劑會趨向于酸性的溶酶體中，在溶酶體內(nèi)富集，對溶酶體內(nèi)的 非靶標酶產(chǎn)生較高的抑制效果，因而堿性較強的抑制劑不利于提高抑制劑的選擇性[14]。因 此，既要保留酰胺鍵中的仲氨基以維持其氫鍵給體的性質(zhì)，還要盡量降低該仲氨基的堿性 從而降低抑制劑分子的整體堿性，成為選擇合適的酰胺鍵替代基的重要因素。
[0008] 在眾多取代基之中，三氟乙胺基（trifluoroethylamino group)是酰胺鍵的生物 等電子體（bioisostere)，在替代擬肽類抑制劑的P2-P3連接基團--酰胺鍵方面有著獨 特的優(yōu)勢。其一，三氟乙胺基內(nèi)存在仲胺基，它保留了氫鍵給體的性質(zhì)。其二，三氟乙胺基 的C-CF3極性與C = 0極性大體相當，對仲胺基有較強的吸電子能力，因而三氟乙胺基的仲 胺和酰胺鍵的仲胺具有相似的堿性。此外，三氟乙胺內(nèi)與氮相連的碳原子采用Sp3雜化，三 氟乙胺基采用四面體的空間排列方式，該空間排列方式會減少對兩側(cè)基團的限制，可能會 使化合物在Cat K內(nèi)采取更好的伸展方位，從而優(yōu)化一些利于抑制劑與酶結(jié)合的相互作用 因素，如氫鍵、范德華力、疏水作用等。另外，三氟乙胺基的四面體構(gòu)型與酰胺鍵水解反應(yīng)的 過渡態(tài)的構(gòu)型類似，避免了三氟乙胺基被蛋白酶或肽酶識別水解，從而提升了化合物的水 解穩(wěn)定性[13，15]。
[0009] 在本專利中，我們在擬肽類肼腈抑制劑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，在P2-P3連接部位引入三 氟乙胺基取代酰胺鍵，制備了新型的分子骨架結(jié)構(gòu)，并通過引入不同P3位取代基獲得了較 相應(yīng)酰胺類抑制劑抑制能力和選擇性均有提高、體外細胞無毒性的新型肼腈類組織蛋白酶 K抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種新型的肼腈類組織蛋白酶K抑制劑，其結(jié)構(gòu)式如下所 示：
[0011]
[0012] 其中Pl位為甲基，P2位為異丁基，P2-P3為三氟乙胺基，P3位為R基，分別是對溴 苯甲基、對二連苯基、對三聯(lián)苯基和對甲基二聯(lián)苯基，其結(jié)構(gòu)式見表1。
[0013] 表1:R基結(jié)構(gòu)式
[0014]
[0015] 相較于以酰胺鍵為P2-P3連接基團的抑制劑，本專利報道的抑制劑的結(jié)構(gòu)創(chuàng)新在 于P2-P3連接基團的變化：酰胺鍵的羰基碳原子采用Sp2雜化，為平面構(gòu)型；三氟乙胺內(nèi)與 氮相連的碳原子采用SP3雜化，使得三氟乙胺基采用四面體的空間排列方式，該空間排列方 式會減少連接基團對兩側(cè)基團的限制，會使化合物在組織蛋白酶K活性位點內(nèi)采取更好的 伸展方位，從而優(yōu)化一些利于抑制劑與酶結(jié)合的相互作用，如氫鍵、范德華力、疏水作用等。
[0016] 相較于以酰胺鍵為P2-P3連接基團的抑制劑，新型抑制劑的性質(zhì)創(chuàng)新在于其抑制 性和選擇性的優(yōu)化：其一，四個化合物對Cat K的抑制常數(shù)&都在皮摩爾級別，反映了化合 物對Cat K的高效抑制能力；其二，當P3位是對二連苯基時，三氟乙胺基替代酰胺鍵提高了 抑制劑對Cat K相較于Cat L和Cat S的選擇性；其三當P3位基團是對三聯(lián)苯基時，三氟 乙胺基替代酰胺鍵既提高了抑制劑對Cat K的抑制力，又削弱了對Cat B、Cat L和Cat S 的抑制力，從兩方面提升了抑制劑對Cat K的選擇性。
[0017] 此外，體外細胞毒性試驗顯示抑制劑對類成骨細胞（human osteoblast-like cell line, MG63)和鼠平滑肌細胞（mouse vascular smooth muscle cell line, M0VAS)均 沒有毒性，這表明該類新型抑制劑具有進入臨床實驗以及成為抗骨質(zhì)疏松癥潛在藥物的可 行性。
[0018] 該系列新型抑制劑小分子的結(jié)構(gòu)簡單，合成原料易得、步驟簡單、易于操作，且產(chǎn) 率很高。在抑制劑小分子的合成過程中，先后采用了 4'-溴_2,2,2_三氟苯乙酮和L-亮 氨酸甲酯鹽的親核反應(yīng)、硼氫化鋅還原亞胺酸鹽的反應(yīng)、氯甲酸異丁酯和氮甲基嗎啉參與 的酰胺化反應(yīng)、芳基硼酸和溴代芳烴參與的鈴木一宮浦反應(yīng)等。具體合成方法見實施例1、 2、3、4、5 和 6〇
[0019] 抑制劑對酶抑制效應(yīng)的檢測
[0020] 測定抑制劑對酶的抑制效應(yīng)，需要檢測在不同濃度抑制劑影響下酶的活性。酶活 性又稱酶活力，是指酶催化反應(yīng)的能力。熒光底物在濃度相當高時，被酶水解后其熒光強 度隨著時間變化，呈一級反應(yīng)關(guān)系，其中直線的斜率表示組織蛋白酶分解底物的初速度，而 初速度的大小即代表酶的活性強弱。將不同抑制劑濃度存在下熒光增強直線的斜率分別除 以空白組（無抑制劑影響）的斜率（附圖19)，得到在特定濃度抑制劑存在下的酶殘余活 力比例。作酶殘余活力比例關(guān)于抑制劑濃度的曲線，即可得到抑制劑對酶的半數(shù)抑制濃度 (IC50)。
[0021] 抑制劑對酶的抑制效應(yīng)可通過IC5tl和1(雇來表示，其中IC5tl是半數(shù)抑制濃度，是指 在一定的實驗條件下將酶的活性降到原有活力一半時所需抑制劑的濃度；Ki是抑制常數(shù)， 代表抑制劑結(jié)合酶能力的強弱，Ki越小，抑制劑結(jié)合酶的能力越強，則抑制能力越強。
[0022] 具體測試步驟見實施例7。
[0023] 本系列抑制劑（I'，2'和3')是用三氟乙胺基替代另一系列抑制劑（1，2和3) 的P2-P31inker酰胺鍵得到的。三氟乙胺基取代原有系列的酰胺鍵，改變了抑制劑抑制效 果和選擇能力。相關(guān)數(shù)據(jù)見表2、表3、表4。
[0024]
[0025] 表2 :化合物1'、2'、3'和4'對組織蛋白酶K、L、B和S的IC5tl值。
[0026]
[0027] 表3:化合物PV對組織蛋白酶K、L、B和S的Ki值。
[0028]
[0029] 表4 :化合物1、2和3對組織蛋白酶K、L、B和S的Ki值。
[0030]
[0031] 抑制劑廣和1的P3位均為對溴苯基，是單環(huán)結(jié)構(gòu)。和抑制劑1相比，三氟乙胺 基代酰胺鍵小幅減弱了抑制劑P對Cat K和Cat L的抑制能力，卻大幅度增強了對Cat B 和Cat S的抑制效果，這使抑制劑P對Cat K選擇性比1的低。因此，當P3位均為對溴苯 基，三氟乙胺基取代酰胺鍵并不能提高抑制劑的性質(zhì)。
[0032] 值得注意的是，抑制劑P和1抑制非靶標酶Cat L的能力都比抑制Cat K