一種具有抗腫瘤活性化合物的分離制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤活性化合物的分離制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 吉祥草（Reineckia carnea (Andr. ) Kunth.)為百合科鈴蘭族吉祥草屬單種屬多年 生常綠草本植物，又名觀音草、松壽蘭、小葉萬年青、竹根七、蛇尾七等。其性味甘平，具有 潤肺止咳、理血、解毒、補(bǔ)腎接骨、祛風(fēng)除濕的功效，主要用于肺結(jié)核、咳嗽咯血、慢性支氣管 炎、哮喘，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，外用治跌打損傷、骨折等疾病的治療，被土家、苗家民間看著是"神 圣的草"。據(jù)分析其主要化學(xué)成分包括：留體皂苷類、黃酮類、三萜類、脂肪酸類、生物堿、神 經(jīng)酰胺、環(huán)醇、燒徑及Ca、Fe、Cu、Zn、Mn、Mg、Na、K等金屬元素。是一種很具有開發(fā)價(jià)值的 少數(shù)民族的草藥資源。
[0003] 當(dāng)前惡性腫瘤成為了嚴(yán)重威脅人口健康的重大疾病。當(dāng)前全球每年惡性腫瘤死亡 人數(shù)約為700萬人，到2030年每年因癌癥死亡的人數(shù)將可能達(dá)到1700萬。據(jù)世界衛(wèi)生組織 統(tǒng)計(jì)，目前全球平均每8個(gè)死亡病例中就有1人死于癌癥，這比艾滋病、結(jié)核病和瘧疾導(dǎo)致 的死亡人數(shù)總和還要高。而且，每年全球還有超過1200萬人被確診患上癌癥。其中中國癌 癥死亡人數(shù)占全球24%，且成低齡化趨勢。手術(shù)、放療和化療仍然是臨床上腫瘤治療的主要 手段，其中化療為其重要手段之一，然后其高額的費(fèi)用和嚴(yán)重的毒副作用，成為了限制其臨 床應(yīng)用的瓶頸。近年來，來源于少數(shù)民族的許多草藥，由于其抗腫瘤療效確切、毒副作用小、 在民間臨床用藥歷史悠久等多方面綜合優(yōu)勢，而成為了治療腫瘤活性先導(dǎo)化合物的寶庫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明發(fā)明人經(jīng)過廣泛深入的研宄，從土家、苗家民間草藥吉祥草中分離 制備得到的甾體皂苷成分：（1 β，3 β，5 β，25S)-螺甾烷-1，3-二醇I-[ a -L-鼠李 糖-(1 - 2) - β -D-木P比喃糖苷]，即 25 (S) -5 β -spirostan-l β，3 β -dioll-〇- a -L-rhamn opyranosyl- (I - 2) - β -D-xylopyranoside (RCE-4)，并且經(jīng)研宄發(fā)現(xiàn)該成分對Η22 和 HepG2 肝癌細(xì)胞及對荷H22瘤昆明小鼠均具有較好的抗腫瘤作用，通過與治療肝癌的陽性藥卡培 他濱比較，與其抗腫瘤效果類似，但未見有明顯的毒副作用。目前還未見有此化合物的制備 分離及治療肝癌相關(guān)的報(bào)道。
[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種從吉祥草中制備分離甾體皂苷RCE-4方法。本發(fā)明 方法包括吉祥草樣品的提取及RCE-4的分離和純化。
[0006] 本發(fā)明具體地是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明提供了一種分離制備留體皂苷RCE-4的方法，包括下面步驟：
[0008] a)用溶劑提取吉祥草，過濾，濃縮；
[0009] b)將a)步得到的濃縮產(chǎn)物用水溶解，用乙酸乙酯萃取一段時(shí)間，優(yōu)選超聲萃取 1~4小時(shí)；
[0010] c)將b)步萃取得到的乙酸乙酯萃取物濃縮，用氯仿-甲醇梯度洗脫分離，收集餾 分1-16,將所得的其中餾分15經(jīng)凝膠色譜分離純化。
[0011] 甾體皂苷RCE-4為針狀晶體，呈白色?；瘜W(xué)名稱為：（1|3,3|3,5|3,255)-螺甾 烷-1，3-二醇1_[ a -L-鼠李糖-(1 - 2)-β -D-木吡喃糖苷]，是一種螺旋甾烷醇皂苷，分 子式為C38H62012。溶解之后為無色透明液體。其分子結(jié)構(gòu)如下式所示：
[0012]
[0013] 在本發(fā)明一種具體的實(shí)施方案中，用常用溶劑提取吉祥草的根莖。吉祥草優(yōu)選 為潔凈、干燥的粉碎形式；提取溶劑可以為水、乙醇或其混合物，優(yōu)選60~95%乙醇，例如 75%乙醇；采用回流提取方式，優(yōu)選在40~70°C例如65°C條件下常壓回流提??；或者過濾 采用中藥提取領(lǐng)域常用的過濾方法，濃縮可以在40~70°C條件下，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃 縮。
[0014] 本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將提取得到的濃縮物用水溶解后，只有用乙酸乙酯萃取一段 時(shí)間，最后才能得到目標(biāo)產(chǎn)物；采用其他溶劑例如石油醚或丁醇萃取將得不到該產(chǎn)物。超聲 萃取可以縮短萃取時(shí)間，例如1~4小時(shí)。
[0015] 將上述萃取得到的乙酸乙酯萃取物濃縮和分離才能得到目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明采用氯 仿-甲醇梯度洗脫分離，收集餾分1-16,將所得的其中餾分15經(jīng)凝膠色譜分離純化后得到 目標(biāo)產(chǎn)物。這里，濃縮可以采用本領(lǐng)域常用的濃縮方法，例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。梯度洗脫優(yōu)選恒梯 度，不僅操作簡便，而且簡單快速、高效地分離目標(biāo)產(chǎn)物。
[0016] 本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，只有第15個(gè)餾分才能分離得到目標(biāo)產(chǎn)物。吉祥草中的化學(xué)成 分通過各種柱色譜色譜分離后得到的皂苷成分中仍然含有一些色素成分；采用凝膠色譜法 除色素比大孔樹脂吸附法和活性炭吸附法更有效。
[0017] 按照本發(fā)明一種具體的實(shí)施方案，其中步驟c)的分離條件為下面一種或多種：
[0018] 1)將上述得到的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行層析分離；
[0019] m)氯仿-甲醇洗脫梯度為恒梯度15:1 ;和 [0020] η)凝膠為葡聚糖凝膠，優(yōu)選羥丙基葡聚糖凝膠。
[0021] 按照本發(fā)明一種具體的實(shí)施方案，其中步驟c)中所述的色譜分離純化后還包括 一重結(jié)晶步驟，純化得到更純的無色針狀結(jié)晶。
[0022] 按照本發(fā)明一種具體的實(shí)施方案，其中步驟b)中用乙酸乙酯萃取之前用石油醚 萃取，殘余物再用乙酸乙酯萃取。這樣可以提高最終產(chǎn)物留體皂苷RCE-4的產(chǎn)率。
[0023] 按照本發(fā)明一種具體的實(shí)施方案，其中步驟a)中所述的溶劑為95%乙醇。
[0024] 按照本發(fā)明一種具體的實(shí)施方案，其中步驟a)中還包括回收乙醇的步驟；優(yōu)選 地，過濾提取液后，在大約55°C條件下，回收乙醇。
[0025] 按照本發(fā)明一種更具體的實(shí)施方案，
[0026] 原料預(yù)處理：將吉祥草根莖洗凈曬干，于40~60°C恒溫鼓風(fēng)箱中干燥至恒重；
[0027] 吉祥草化學(xué)成分的提取：①回流提?。簶悠非谐尚∑?0~95%乙醇為溶劑，在 40~70°C條件下常壓回流提取，提取液過濾后，在40~70°C條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮； ②萃取：將濃縮所得的浸膏，用蒸餾水溶解，用乙酸乙酯超聲萃取1~4小時(shí)；
[0028] 吉祥草中RCE-4的分離純化：將萃取得到乙酸乙酯浸膏用氯仿-甲醇梯度洗脫，收 集流分，將所得的其中一流份15經(jīng)S印hadex LH-20洗脫，即得。
[0029] 本發(fā)明分離制備得到的RCE-4在H22和H印G2人肝癌細(xì)胞上和荷H 22瘤昆明小鼠上 實(shí)驗(yàn)，表明具有抗肝癌的治療作用。
[0030] 本發(fā)明還從細(xì)胞和動(dòng)物水平上證明了 RCE-4具有很好的治療肝癌的作用。
[0031] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述的方法獲得的甾體皂苷RCE-4。
[0032] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的留體皂苷 RCE-4〇
[0033] 按照本發(fā)明一種具體的實(shí)施方案，其中所述的藥物組合物還包含自噬抑制劑 3-MA，任選地還含有其他抗癌藥物活性成分和/或載體、稀釋劑或賦形劑。
[0034] 按照本發(fā)明一種具體的實(shí)施方案，其中所述藥物組合物中RCE-4濃度在2~4 μ M 之間，優(yōu)選4 μ Μ。
[0035] 本發(fā)明的有益效果
[0036] 本發(fā)明提供了一種從土家、苗家族民間草藥一吉祥草中分離制備RCE-4的方法， 研宄顯示RCE-4對正常細(xì)胞如猴腎細(xì)胞、犬腎細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小，但是對人肝癌細(xì)胞（H22和!fepG2)具有很顯著的生長抑制作用，并且呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性；可抑制荷H22腹水 瘤小鼠抑制腹水的生成及存活時(shí)間；可顯著抑制荷H22實(shí)體瘤小鼠瘤體積和瘤重，對小鼠的 血液常規(guī)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)和免疫系統(tǒng)和組織形態(tài)學(xué)均沒有顯著性的副作用，而陽性藥 卡培他濱盡管其抑瘤效果略強(qiáng)于RCE-4,但是它是以高劑量、強(qiáng)副作用見長，因此，與其相比 較具有毒副作用小、療效較好的優(yōu)勢，值得開發(fā)應(yīng)用。
【附圖說明】
[0037] 圖1為吉祥草提取步驟流程圖，
[0038] 圖2為吉祥草萃取步驟圖，
[0039] 圖3為吉祥草中RCE-4的分離步驟流程圖，
[0040] 圖4吉祥草乙酸乙酯部位分離流程圖
[0041] 圖5為吉祥草正丁醇部位分離流程圖，
[0042] 圖6吉祥草正丁醇部位WQ-F系列分離流程圖，
[0043] 圖7 RCE-4對marc-145和MDCK細(xì)胞毒活性的影響，
[0044] 圖8 RCE-4對H22和H印G2人肝癌細(xì)胞細(xì)胞毒活性的影響，
[0045] 圖9 RCE-4對H22荷腹水瘤小鼠生存時(shí)間的影響，
[0046] 圖10 RCE-4對H22實(shí)體瘤小鼠移植瘤組織形態(tài)學(xué)的影響（A:模型組，B :RCE-4低 劑量組，C :RCE-4中劑量組，D :RCE-4高劑量組，E :卡培他濱組，HE染色），
[0047] 圖11 RCE-4對H22實(shí)體瘤小鼠主要臟器組織形態(tài)學(xué)的影響（A:腦，B :心，C :肝， D :腎，E :腎上腺，F(xiàn) :脾，G :胃，H :十二指腸 ，I :大腸 ，J :小腸，HE染色），
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，這些實(shí)施例僅是對本發(fā)明的舉例說明 而已，無論如何不能解釋為對本發(fā)明范圍的限制。
[0049] 實(shí)施例1
[0050] 吉祥草中一種具有抗腫瘤活性化合物RCE-4,具體通過以下方法制備：
[0051] 1)吉祥草預(yù)處理
[0052] 吉祥草根莖洗凈曬干，取0. 005kg保存，剩下的于48°C恒溫鼓風(fēng)箱中干燥至恒重， 凈重4. 0kg。
[0053] 2)吉祥草回流提取
[0054] 樣品切成小段，以95%乙醇為溶劑，在65°C條件下常壓回流提取，提取液過濾后， 在55°C條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，隨后在通風(fēng)櫥中揮干至無醇味，得深浸膏，稱重得浸膏 I. 4kg(見圖 1)。
[0055] 3)吉祥草浸膏的萃取
[0056] 加入1升蒸餾水溶解上述2)所得浸膏，依次用萃取劑石油醚、乙酸乙酯、水飽和的 正丁醇萃取。每次加入2L萃取劑與浸膏水溶液混勻，超聲萃取2小時(shí)待兩相分層后，利用 虹吸法原理將上層的萃取液吸出，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮并回收萃取液，回收后的溶劑繼續(xù) 用于萃取。合并同一種萃取溶劑的萃取物，于通風(fēng)櫥中揮干溶劑，最后得各浸膏（見圖2)。 稱重得各浸膏量：石油醚部分重130g，乙酸乙酯部分重112g ;正丁醇部分重550g。
[0057] 4)吉祥草中一種具有抗腫瘤活性化合物RCE-4的分離：
[0058] 將上述3)得到的乙酸乙酯部位浸膏（70克）進(jìn)行硅膠柱層析，采用氯仿-甲醇= 15 :1梯度洗脫，共得十六個(gè)組分，其中5、10、15主斑點(diǎn)明顯，5號和10號組分經(jīng)甲醇重結(jié) 晶得白色針狀結(jié)晶WQ-E-4(f3-胡蘿卜苷）和WQ-E(RCE-2)。然后將15號組分經(jīng)S印hadex LH-20 (甲醇裝柱或者氯仿